Pleiotropic functions of the yeast Greatwall-family protein kinase Rim15p: a novel target for the control of alcoholic fermentation
- 作者
- Daisuke Watanabe, Hiroshi Takagi
- 单位
- 奈良科学技术大学院大学生物科学研究科，日本生驹
- 杂志
- 生物科学、生物技术与生物化学（2017）
- DOI
- 10.1080/09168451.2017.1295805
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
揭示清酒酵母菌株高酒精发酵性能的遗传基础，特别是Rim15p蛋白激酶功能缺失如何增强酒精发酵，以及如何利用该机制改良工业酵母的发酵性能。
研究策略
综合运用全基因组测序、转录组分析、代谢组分析（CE-TOFMS）、基因操作和发酵实验，鉴定清酒酵母中RIM15基因的功能缺失突变，并解析其通过调控UDP-葡萄糖合成途径影响糖酵解和酒精发酵的分子机制。
核心内容
该研究综合运用全基因组测序、转录组与代谢组分析及基因操作等手段，鉴定出清酒酵母高酒精发酵性能的关键遗传决定因子——RIM15基因的双等位基因单腺嘌呤插入突变（rim15 5055insA），该突变导致Greatwall家族蛋白激酶Rim15p功能完全丧失。将这一突变引入实验室菌株BY4743后，20天清酒发酵的乙醇产量从11 vol%提升至17 vol%。机制解析显示，Rim15p通过诱导UGP1基因表达促进UDP-葡萄糖合成，从而抑制糖酵解；其功能缺失使碳流从海藻糖、糖原及细胞壁β-葡聚糖等贮存性碳水化合物的合成转向糖酵解和酒精发酵，细胞内G1P水平升高而UDPG水平降低。进一步实验证实，下调UGP1表达可浓度依赖性地提高发酵速率，且RIM15缺失同样能增强PE-2生物乙醇菌株和拉格啤酒酵母的发酵性能。该研究首次将Rim15p确立为酒精发酵调控的新型通用靶点，为工业酵母的定向育种改良提供了明确基因操作位点。
创新点
首次发现清酒酵母中RIM15基因的特定功能缺失突变（rim15 5055insA）是高发酵性能的遗传决定因子；阐明了Rim15p通过调控UGP1表达和UDP-葡萄糖生物合成抑制酒精发酵的新代谢调控机制；将Rim15p确立为改良工业酵母（如生物乙醇酵母和拉格啤酒酵母）发酵性能的新型通用靶点。
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母（清酒酵母K7/K701） | 酒精发酵/静止期调控 | RIM15 | Rim15p | 调控 | Greatwall家族蛋白激酶，其功能缺失突变rim15 5055insA导致高发酵性能 |
| 酿酒酵母（实验室菌株BY4743） | 酒精发酵 | RIM15 | Rim15p | 调控 | 缺失RIM15增加发酵速率，引入rim15 5055insA突变使乙醇产量从11 vol%升至17 vol% |
| 酿酒酵母 | 静止期/胁迫响应 | MSN2/MSN4 | Msn2p/Msn4p | 调控 | 转录因子，Rim15p的下游靶点，调控UGP1表达 |
| 酿酒酵母 | 热激应答/静止期 | HSF1 | Hsf1p | 调控 | 转录因子，Rim15p的下游靶点，调控UGP1表达 |
| 酿酒酵母 | UDP-葡萄糖合成途径 | UGP1 | Ugp1p | 催化 | UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，催化G1P+UTP→UDPG，其表达受Rim15p调控，下调表达增加发酵速率 |
| 酿酒酵母 | 糖原/海藻糖/β-葡聚糖合成 | PGM1/PGM2 | Pgm1p/Pgm2p | 催化 | 磷酸葡萄糖变位酶，催化G6P→G1P |
| 酿酒酵母 | 海藻糖合成 | TPS1 | Tps1p | 催化 | 海藻糖-6-磷酸合酶，与Rim15p相互作用 |
| 酿酒酵母 | Greatwall信号通路 | IGO1/IGO2 | Igo1p/Igo2p | 调控 | α-内硫因同源物，Rim15p磷酸化后抑制PP2A |
| 酿酒酵母 | PP2A磷酸酶通路 | CDC55 | PP2A-Cdc55p | 调控 | 蛋白磷酸酶2A的B55亚基，被Igo1/2p抑制，参与细胞周期和应激响应调控 |
| 酿酒酵母 | 糖原合成 | GLG2 | Glg2p | 催化 | 糖原蛋白，糖原合成起始因子 |
| 酿酒酵母 | Hsf1p调控 | PPT1 | Ppt1p | 调控 | 推测的Hsf1p上游激活蛋白磷酸酶 |
| 巴斯德酿酒酵母（Weihenstephan 34/70） | 酒精发酵（高浓度麦汁） | RIM15 | Rim15p | 调控 | 删除S. cerevisiae型RIM15基因增强糖消耗和发酵速率 |
| 酿酒酵母（PE-2衍生株） | 蔗糖糖蜜酒精发酵 | RIM15 | Rim15p | 调控 | 删除RIM15显著提高发酵速率并缩短发酵时间 |
关键发现
- 清酒酵母K7相关菌株中RIM15基因双等位基因均携带单腺嘌呤插入突变rim15 5055insA，导致蛋白功能完全丧失
- 将这一突变引入实验室菌株BY4743后，20天清酒发酵的乙醇产量从11 vol%提高到17 vol%
- RIM15缺失显著提高实验室菌株、PE-2生物乙醇菌株和S. pastorianus的发酵速率并缩短发酵时间
- RIM15缺失导致细胞内海藻糖、糖原和细胞壁1,3-β-葡聚糖积累减少，同时增加G1P水平、降低UDPG水平，提示Ugplp活性下降
- 通过Dox可抑制启动子下调UGP1表达可浓度依赖性地提高发酵速率。
研究结论
Rim15p通过诱导UGP1基因表达促进UDP-葡萄糖合成，从而抑制糖酵解和酒精发酵；其功能缺失使碳流从贮存性碳水化合物合成转向糖酵解和酒精发酵，从而增强发酵性能。RIM15是酒精发酵调控的关键靶点，可用于开发定制化的工业酵母育种技术。