A modern purification method for volatile sesquiterpenes produced by recombinant Escherichia coli carrying terpene synthase genes
- 作者
- Kazutoshi Shindo
- 单位
- Department of Food and Nutrition, Japan Women's University, Tokyo, Japan
- 杂志
- Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry（2017）
- DOI
- 10.1080/09168451.2017.1403882
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
传统蒸馏和制备气相色谱纯化挥发性倍半萜需要专门设备，不适合普通实验室；需建立简便的现代纯化方法。
研究策略
利用重组大肠杆菌表达萜烯合酶基因，在正辛烷/TB培养基两相体系中培养以捕获挥发性倍半萜，再通过两相分配、硅胶柱层析和反相制备HPLC纯化，并用NMR、旋光和GC-MS确定结构。
核心内容
本研究建立了一种适用于普通实验室的挥发性倍半萜纯化方法。作者利用重组大肠杆菌BL21(DE3)表达多种萜烯合酶基因，在正辛烷/TB培养基两相体系中培养，以非毒性正辛烷作为捕获溶剂收集挥发性倍半萜，随后通过两相分配、硅胶柱层析和反相制备HPLC逐步纯化，并结合NMR、旋光和GC-MS进行结构鉴定。该方法成功纯化并鉴定了14种挥发性倍半萜，包括(3R)-nerolidol、valerianol、β-eudesmol、germacrene A和δ-cadinene等。抗氧化活性测试显示，δ-cadinene活性最强，IC50为3.2 μM，优于阳性对照儿茶素（IC50=4.0 μM），而其他倍半萜的IC50在24 μM至大于200 μM之间。该纯化策略简便通用、回收率高，不仅适用于重组大肠杆菌来源的倍半萜，也可推广至植物来源样品，为挥发性萜类化合物的结构解析和生物活性评估提供了有效工具。
创新点
采用正辛烷作为非毒性捕获溶剂，可在减压下去除；两相培养避免细胞损伤；结合现代色谱技术，回收率高，可获得高纯度倍半萜用于结构鉴定和生物活性研究。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径 | pAC-MeV/Scidi/Aacl | 甲羟戊酸途径酶类 | 催化 | 提供IPP/DMAPP前体，用于合成倍半萜 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | HILIS/NES | Linalool/Nerolidol synthase | 催化 | 来自Humulus lupulus，产生(3R)-nerolidol和(3R)-linalool |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | CbTps1 | 萜烯合酶 | 催化 | 来自Camellia brevistyla，产生hedcyaroyl |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | ChTps1 | Valerianol synthase | 催化 | 来自Camellia，产生valerianol |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | ZzZss2 (ZSS2) | β-Eudesmol synthase | 催化 | 来自Zingiber zerumbet，产生β-eudesmol |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | ZoTps1 | β-Bisabolene synthase | 催化 | 来自Zingiber officinale，产生β-bisabolene |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | AcTps1 | 倍半萜合酶 | 催化 | 来自Araliaceae，产生germacrene A、α-copaene、δ-cadinene、β-cubebene、germacrene D |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | AcTps2 | 倍半萜合酶 | 催化 | 来自Araliaceae，产生germacrene A、β-panasinen、2-epi-β-caryophyllene、α-humulene |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | AeTps1 | 倍半萜合酶 | 催化 | 来自Araliaceae，产物未鉴定 |
关键发现
- 建立了两相培养（正辛烷/TB培养基）结合两相分配、硅胶柱层析和反相HPLC的纯化方法，成功从重组大肠杆菌培养物中纯化并鉴定了14种挥发性倍半萜，如(3R)-nerolidol、valerianol、β-eudesmol、β-bisabolene、germacrene A、δ-cadinene等。抗氧化活性测试显示δ-cadinene活性最强，IC50=3.2 μM，优于阳性对照儿茶素（IC50=4.0 μM）
- 其他倍半萜IC50值分别为：germacrene A 50 μM，β-caryophyllene 24 μM，α-copaene 36 μM，β-cubebene 32 μM，germacrene D 34 μM，valerianol 180 μM，(3R)-nerolidol >200 μM，β-bisabolene >200 μM。
研究结论
该纯化方法简单通用，不仅适用于重组大肠杆菌产生的挥发性倍半萜，也适用于植物来源的倍半萜，并支持结构解析和生物活性评估。