CrBPF1 overexpression alters transcript levels of terpenoid indole alkaloid biosynthetic and regulatory genes
- 作者
- Chun Yao Li, Alex L. Leopold, Guy W. Sander, Jacqueline V. Shanks, Le Zhao, Susan I. Gibson
- 单位
- Department of Plant Biology, University of Minnesota Twin Cities, Saint Paul, MN, USA; Department of Chemical Engineering, University of Minnesota Duluth, Duluth, MN, USA; Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University, Ames, IA, USA
- 杂志
- Frontiers in Plant Science（2015）
- DOI
- 10.3389/fpls.2015.00818
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
CrBPF1是MYB样蛋白，先前推测可能调节TIA生物合成基因STR，但它在TIA及相关途径中的调控作用尚未被系统表征。本文旨在通过过表达CrBPF1揭示其对TIA生物合成和调控基因转录水平的影响，明确其在TIA代谢调控中的角色。
研究策略
构建受β-雌二醇诱导启动子控制的CrBPF1过表达转基因长春花发根（CrBPF1-OE），利用qRT-PCR追踪31个TIA生物合成和调控基因在72小时内的转录水平，利用HPLC检测14种TIA及前体代谢物（其中9种可检测）的水平变化，并进行启动子CrBPF1结合位点的序列分析。
核心内容
研究者构建了受β-雌二醇诱导启动子控制的CrBPF1过表达转基因长春花发根，通过qRT-PCR追踪31个萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成及调控基因在72小时内的转录变化，并用HPLC检测代谢物水平。诱导后6小时内CrBPF1转录本上升约50倍并持续至少72小时，内源表达不受影响。吲哚途径中TDC在12小时升高75%，萜类途径中LAMT升高约2.5倍、DXS2B升高约2倍，但DXS1在72小时降低70%；TIA合成基因中SGD升高75%、16OMT升高2.6倍、DAT升高约3倍。调控基因方面，ORCA3最大升高2.4倍，CrMYC1升高近4倍，而全部5个转录抑制子（ZCT1-3、GBF1/2）也均被上调。代谢物层面仅有微小变化，最大效应为蛇根碱在12小时降低约40%，其余可检测代谢物无显著改变。这一结果表明CrBPF1广泛同时上调TIA途径的转录激活子和抑制子，但整体代谢通量几乎不变，提示其可能作为“微调”调节因子，精细调控基因表达的时机与幅度，而非直接驱动代谢产物积累。
创新点
['首次系统表征CrBPF1（MYB样转录因子）对TIA生物合成及调控基因转录水平的全局影响', '发现CrBPF1过表达同时上调TIA转录激活子和抑制子（13个调控基因中11个受影响）', "提出CrBPF1作为TIA生物合成'微调'调节因子的新模型"]
研究对象（31）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | 吲哚途径 | ASα | 邻氨基苯甲酸合酶α亚基（anthranilate synthase α subunit） | 催化 | 催化色氨酸合成途径的第一个限速步骤 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | 吲哚途径 | TDC | 色氨酸脱羧酶（tryptophan decarboxylase） | 催化 | 催化色氨酸形成色胺 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | 萜类途径（MEP途径） | DXS1 | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶1（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase 1） | 催化 | MEP途径第一个限速酶 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | 萜类途径（MEP途径） | DXS2A | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶2A（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase 2A） | 催化 | 受ORCA3调节的DXS同工酶 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | 萜类途径（MEP途径） | DXS2B | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶2B（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase 2B） | 催化 | 受ORCA3调节的DXS同工酶 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | 萜类途径（单萜） | G10H | 香叶醇10-羟化酶（geraniol 10-hydroxylase） | 催化 | 催化香叶醇羟化进入单萜途径 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | 萜类途径（单萜） | CPR | 细胞色素P450还原酶（cytochrome P450 reductase） | 催化 | 为细胞色素P450酶提供电子 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | 萜类途径（单萜） | LAMT | 洛甘酸O-甲基转移酶（loganic acid O-methyltransferase） | 催化 | 参与裂环马钱苷前体生物合成 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | TIA生物合成途径 | STR | 马钱苷合酶（strictosidine synthase） | 催化 | 催化色胺与裂环马钱苷缩合形成马钱苷，是TIA途径的第一个关键酶 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | TIA生物合成途径 | SGD | 马钱苷β-D-葡萄糖苷酶（strictosidine β-D-glucosidase） | 催化 | 催化马钱苷去糖基化形成马钱苷苷元 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | TIA生物合成途径（文多灵分支） | T16H1 | 他波宁16-羟化酶1（tabersonine 16-hydroxylase 1） | 催化 | 文多灵生物合成步骤 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | TIA生物合成途径（文多灵分支） | T16H2 | 他波宁16-羟化酶2（tabersonine 16-hydroxylase 2） | 催化 | 文多灵生物合成步骤 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | TIA生物合成途径（文多灵分支） | 16OMT | 16-羟基他波宁O-甲基转移酶（16-hydroxytabersonine O-methyltransferase） | 催化 | 文多灵生物合成步骤 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | TIA生物合成途径（文多灵分支） | D4H | 脱乙酰氧基文多灵4-羟化酶（desacetoxyvindoline 4-hydroxylase） | 催化 | 文多灵生物合成步骤 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | TIA生物合成途径（文多灵分支） | DAT | 脱乙酰文多灵4-O-乙酰转移酶（deacetylvindoline 4-O-acetyltransferase） | 催化 | 文多灵生物合成最后一步 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | TIA生物合成途径（末端） | PRX1 | 液泡III类过氧化物酶（vacuolar class III peroxidase） | 催化 | 催化长春质碱与文多灵偶联形成α-3',4'-脱水长春花碱 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | TIA生物合成途径（洛希宁/荷哈默里辛分支） | T19H | 他波宁/洛希宁19-羟化酶（tabersonine/lochnericine 19-hydroxylase） | 催化 | 参与洛希宁和荷哈默里辛合成 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | TIA生物合成途径（洛希宁/荷哈默里辛分支） | MAT | 米诺文宁19-O-乙酰转移酶（minovincinine-19-O-acetyltransferase） | 催化 | 参与荷哈默里辛合成 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | TIA生物合成调控 | ORCA2 | AP2结构域转录因子ORCA2（octadecanoid-responsive Catharanthus AP2-domain protein 2） | 调控 | TIA转录激活子，结合STR启动子JERE元件 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | TIA生物合成调控 | ORCA3 | AP2结构域转录因子ORCA3（octadecanoid-responsive Catharanthus AP2-domain protein 3） | 调控 | TIA转录激活子，响应茉莉酸信号 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | TIA生物合成调控 | CrBPF1 | MYB样转录因子CrBPF1（MYB-like protein） | 调控 | 本研究过表达的目标转录因子，结合STR启动子BA元件 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | TIA生物合成调控 | CrMYC1 | bHLH转录因子CrMYC1（basic helix-loop-helix transcription factor） | 调控 | 调节STR表达，响应茉莉酸和激发子 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | TIA生物合成调控 | CrMYC2 | bHLH转录因子CrMYC2（basic helix-loop-helix transcription factor） | 调控 | 控制ORCA基因的茉莉酸响应表达 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | TIA生物合成调控 | CrWRKY1 | WRKY转录因子CrWRKY1 | 调控 | 正调控多个TIA生物合成基因 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | TIA生物合成调控 | CrWRKY2 | WRKY转录因子CrWRKY2 | 调控 | 正调控多个TIA生物合成基因 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | TIA生物合成调控 | BIS1 | bHLH转录因子BIS1 | 调控 | 调控萜类途径中香叶基二磷酸转化为洛甘酸的全部酶基因 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | TIA生物合成调控 | ZCT1 | 锌指蛋白转录抑制子ZCT1（zinc finger protein 1） | 调控 | TIA转录抑制子 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | TIA生物合成调控 | ZCT2 | 锌指蛋白转录抑制子ZCT2（zinc finger protein 2） | 调控 | TIA转录抑制子 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | TIA生物合成调控 | ZCT3 | 锌指蛋白转录抑制子ZCT3（zinc finger protein 3） | 调控 | TIA转录抑制子 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | TIA生物合成调控 | GBF1 | G-box结合因子1（G-box binding factor 1） | 调控 | TIA转录抑制子，结合G-box元件 |
| 长叶长春花发根（Catharanthus roseus hairy roots） | TIA生物合成调控 | GBF2 | G-box结合因子2（G-box binding factor 2） | 调控 | TIA转录抑制子，结合G-box元件 |
关键发现
- CrBPF1转基因转录本在β-雌二醇诱导后6小时内上升约50倍，并持续至少72小时
- 内源CrBPF1表达不受自身过表达影响。过表达CrBPF1导致吲哚途径基因ASα在12小时达峰、TDC在12小时升高75%
- 萜类途径基因LAMT在12小时升高约2.5倍、G10H和CPR轻度上调（最大约1.5-2倍）、DXS2B在6和12小时分别升高1.6和2.0倍，但DXS1在72小时降低70%
- TIA生物合成基因中SGD在12小时升高75%、16OMT在12小时升高2.6倍、T19H在48小时升高2.3倍、DAT在12小时升高约3倍但48小时降低约2倍，D4H在12和48小时显著升高，而STR、T16H1、T16H2、PRX1和MAT无显著变化。调控基因方面，ORCA2在48小时升高约60%，ORCA3在48小时最大升高2.4倍，CrMYC1在6和12小时升高近4倍，CrMYC2在多数时间点升高30-60%，CrWRKY1在12和48小时升高30%，BIS1在12小时升高60%
- 同时所有5个转录抑制子均被上调：ZCT1升高2-3倍，ZCT2升高1.25-2倍，ZCT3升高2-2.5倍，GBF1在大部分时间点显著升高，GBF2在12小时升高约40%。代谢物层面，CrBPF1过表达对TIA代谢物水平仅有微小影响，最大显著变化是蛇根碱（serpentine）在12小时降低约40%，其他可检测代谢物（他波宁、洛希宁、荷哈默里辛、长春质碱、阿吗碱、马钱苷）无显著或仅短暂变化。
研究结论
CrBPF1过表达广泛影响TIA生物合成和调控基因的转录水平，但代谢物水平变化很小，因为CrBPF1同时上调转录激活子和抑制子，提示CrBPF1可能作为'微调'调节因子，帮助调节TIA基因表达的时机和幅度。