Reversible Hydrogenase Activity Confers Flexibility to Balance Intracellular Redox in Moorella thermoacetica
- 作者
- Shunsuke Kobayashi, Junya Kato, Keisuke Wada, Kaisei Takemura, Setsu Kato, Tatsuya Fujii, Yuki Iwasaki, Yoshiteru Aoi, Tomotake Morita, Akinori Matsushika, Katsuji Murakami, Yutaka Nakashimada
- 单位
- Graduate School of Integrated Sciences for Life, Hiroshima University; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Tsukuba; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Higashihiroshima
- 杂志
- Frontiers in Microbiology（2022）
- DOI
- 10.3389/fmicb.2022.897066
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
探究可逆氢酶活性如何平衡 Moorella thermoacetica 胞内氧化还原状态，以及 H2 补充对工程菌乙醇生产的影响，揭示 H2 混合营养策略在工程菌中的局限性。
研究策略
通过基因工程构建产乙醇和产丙酮的 M. thermoacetica 工程菌，结合 H2 补充实验、代谢组学分析、H2 产生监测以及 DMSO 还原 NADH 实验，研究可逆氢酶在维持胞内氧化还原平衡中的作用。
核心内容
该研究以产乙醇和产丙酮的嗜热厌氧菌Moorella thermoacetica工程菌为对象，探究可逆氢酶活性在平衡胞内氧化还原状态中的作用及H2补充对发酵的影响。通过构建表达醛脱氢酶（aldh）的产乙醇菌株和产丙酮菌株，结合H2供给、代谢组学、H2监测及DMSO还原实验发现：野生型在H2下乙酸碳摩尔产率从0.74升至0.82，但产乙醇菌株果糖消耗仅40.2%，乙醇体积产量从17.6 mM降至8.0 mM，且H2抑制呈剂量依赖；代谢组学显示产乙醇菌株NADH水平升高约4倍，添加10 mM DMSO消耗NADH后可恢复生长，揭示可逆氢酶通过产H2氧化多余NADH以维持氧化还原平衡。产丙酮菌株氧化还原状态不受影响，H2条件下丙酮产量提高13%，总碳摩尔产率大于1。结果表明，H2混合营养策略对产乙醇工程菌无效甚至有害，只有先调整胞内氧化还原平衡才能受益，这为设计H2辅助发酵路径提供了关键依据。
创新点
首次揭示工程产乙醇菌株通过可逆氢酶产生 H2 来氧化 NADH 以平衡胞内还原力，且 H2 补充会剂量依赖地抑制其生长；利用 DMSO 消耗 NADH 可恢复生长；证明氧化还原平衡调节对 H2 混合营养发酵至关重要。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Moorella thermoacetica ATCC 39073 | Wood-Ljungdahl 途径（乙酸合成） | — | HydABC 复合物（可逆[FeFe]氢酶） | 催化 | 催化 H2 与 NADH/铁氧还蛋白之间的可逆电子转移，用于平衡胞内还原力 |
| Moorella thermoacetica ATCC 39073 | Wood-Ljungdahl 途径（乙酸合成） | — | Ech 复合物 | 能量供给 | 膜结合能量转换氢酶，将铁氧还蛋白的电子转化为 H2 并参与能量守恒 |
| Moorella thermoacetica ATCC 39073 | Wood-Ljungdahl 途径（乙酸合成） | — | NfnAB 复合物 | 催化 | 电子歧化酶，催化铁氧还蛋白和 NADH 向 NADP+ 的电子转移，生成 NADPH |
| Moorella thermoacetica ATCC 39073 | 乙醇合成途径 | aldh | 醛脱氢酶 | 催化 | 催化乙醛还原为乙醇，消耗 NADH |
| Moorella thermoacetica ATCC 39073 | 乙酸合成途径 | pduL1, pduL2 | 磷酸转乙酰酶 | 催化 | 催化乙酰辅酶A转化为乙酰磷酸，乙酸合成关键酶；敲除可增强乙醇生产 |
| Moorella thermoacetica ATCC 39073 | 丙酮合成途径 | ctfAB, thl, adc | 辅酶A转移酶、硫解酶、乙酰乙酸脱羧酶 | 催化 | 引入丙酮合成途径，不涉及氧化还原反应，维持胞内氧化还原平衡 |
| Moorella thermoacetica ATCC 39073 | 电子传递/氧化还原平衡 | — | DMSO 还原酶 | 催化 | 利用 NADH 还原 DMSO 为 DMS，实验中用于消耗胞内 NADH 以恢复 H2 抑制下的生长 |
关键发现
- 野生型添加 H2 后乙酸碳摩尔产率从
- 74 提高至
- 82；Mt-aldh 乙酸产率从
- 78 提高至
- 88，乙醇产率无显著变化（0.02 vs
- 03）；Mt-ΔpduL2::aldh 乙酸产率从
- 19 提高至
- 25，乙醇产率保持
- 37；Mt-ΔpduL1ΔpduL2::aldh 乙醇产率从
- 47 提高至
- 54，但 H2 条件下果糖消耗仅
- 2%，乙醇体积产量从
- 6 mM 降至
- 0 mM；H2 抑制呈剂量依赖，与 H2 分压线性相关；代谢组学显示 H2 条件下产乙醇菌株 NADH 水平升高约 4 倍，而野生型不受影响；添加 10 mM DMSO 后生长恢复，NADH 水平降低；产丙酮工程菌在 H2 条件下乙酸和丙酮产量均提高，丙酮提高 13%，总碳摩尔产率大于 1。
研究结论
可逆氢酶活性赋予 M. thermoacetica 平衡胞内氧化还原状态的灵活性与能力；H2 补充对产乙醇工程菌无效甚至有害，必须调整氧化还原平衡才能受益于 H2 混合营养；产丙酮菌株由于氧化还原平衡不受影响，能有效利用 H2 提高碳利用效率。