Absolute quantitation of poly(R)-3-hydroxybutyric acid using spectrofluorometry in recombinant Escherichia coli
- 作者
- Mayooreshwar P. Rajankar, Sapna Ravindranathan, P.R Rajamohanan, Anu Raghunathan
- 单位
- Chemical Engineering Division, CSIR- National Chemical Laboratory, Dr. Homi Bhabha Road, Pune 411008, India; Central NMR Facility, CSIR- National Chemical Laboratory, Dr. Homi Bhabha Road, Pune 41008, India
- 杂志
- Biology Methods and Protocols（2018）
- DOI
- 10.1093/biomethods/bpy007
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
缺乏快速、准确、定量且可扩展的聚(R)-3-羟基丁酸(PHB)检测方法，现有方法需样量大、操作繁琐、灵敏度低，且受细胞成分干扰。
研究策略
在尼罗红荧光法基础上增加超声破碎和乙醇提取两个步骤，并通过蛋白消化步骤消除过表达蛋白的荧光干扰，实现对重组大肠杆菌中PHB的绝对定量。
核心内容
该研究开发了一种基于尼罗红荧光光谱法对重组大肠杆菌中聚(R)-3-羟基丁酸（PHB）进行绝对定量的新方法。在传统尼罗红染色基础上引入超声破碎和乙醇提取步骤，并增设蛋白消化处理以消除过表达蛋白的背景荧光干扰。校准曲线在125–1000 μg/ml范围内线性良好（r²=0.9894），检测限为41.12 μg/ml，定量限为124.6 μg/ml，动态范围较UV分光光度法提高约一个数量级。以甘油为碳源时，重组菌24小时内PHB最大产量为139.73±9.02 μg/ml，与UV法结果接近。关键发现是过表达蛋白可贡献高达24%–100%的荧光信号，在葡萄糖和LB培养基中甚至全部荧光源于蛋白，导致假阳性结果；经蛋白消化校正后，NMR确认仅甘油培养细胞真正合成PHB。该方法快速准确、样品量低且可扩展至其他聚羟基脂肪酸酯检测，为代谢工程和高通量筛选提供了可靠工具。
创新点
1. 将超声和乙醇提取引入尼罗红荧光法，提高动态范围和检测限/定量限；2. 增加蛋白消化步骤，校正细胞中过表达蛋白产生的背景荧光，提高准确性；3. 方法快速、准确、重现性好，样品量需求低，可扩展至其他PHA及塑料检测。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH10β | PHB合成途径 | pctap | Pctap | 催化 | 丙酰辅酶A转移酶，来源于Acetobacter pasteurianus 386B，催化CoA转移至底物 |
| Escherichia coli DH10β | PHB合成途径 | phaCcv | PhaCcv | 催化 | PHA聚合酶，来源于Chromobacterium violaceum ATCC 12472，催化PHB聚合 |
| Escherichia coli DH10β | PHB合成途径 | araBAD promoter | — | 调控 | L-阿拉伯糖诱导型启动子，用于控制pctap和phaCcv的共表达 |
关键发现
- 超声+乙醇提取荧光法的校准曲线在125-1000 μg/ml范围内线性良好，回归方程y=360.1x+1366，r²=0.9894；LOD=41.12 μg/ml，LOQ=124.6 μg/ml，动态范围124.6-1000 μg/ml，相对误差9.59%，RSD
- 27%。相比UV分光光度法（动态范围20-100 μg/ml），动态范围提高约一个数量级。重组大肠杆菌以甘油为碳源，24 h内PHB最大产量为139.73±9.02 μg/ml（本方法），而UV法测得154.02±6.87 μg/ml。在LB培养基添加葡萄糖时，UV法在无PHB合成情况下出现相当于38 μg/ml PHB的假阳性信号；荧光法测得14633 a.u和12579 a.u的荧光强度，分别导致36.84±4.32和31.14±13.01 μg/ml的PHB高估。蛋白消化后，甘油培养细胞中过表达蛋白贡献了24%的荧光，而LB和葡萄糖培养的细胞中100%荧光来自蛋白。过表达蛋白占总细胞蛋白比例分别为：葡萄糖8.9%、甘油38.9%、LB
- 8%。NMR确认甘油培养细胞产生PHB，而葡萄糖和LB培养无PHA信号。
研究结论
开发了一种基于尼罗红荧光光谱的PHB绝对定量方法，通过超声、乙醇提取和蛋白消化步骤，实现了重组大肠杆菌中PHB的快速、准确、可重现定量，有效克服了颗粒聚集、脂质背景和蛋白荧光干扰，适用于代谢工程和高通量筛选。