Overexpression of acetyl-CoA synthetase in Saccharomyces cerevisiae increases acetic acid tolerance
- 作者
- Jun Ding, Garrett Holzwarth, Michael H. Penner, Jana Patton-Vogt, Alan T. Bakalinsky
- 单位
- Department of Biochemistry and Biophysics, Oregon State University; Department of Food Science and Technology, Oregon State University; Department of Biological Sciences, Duquesne University
- 杂志
- FEMS Microbiology Letters（2015）
- DOI
- 10.1093/femsle/fnu042
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
乙酸是木质纤维素水解液中的主要抑制物，抑制酿酒酵母发酵，本研究旨在通过基因工程提高酵母对高浓度乙酸的耐受性。
研究策略
在酿酒酵母中过表达编码乙酰辅酶A合成酶的ACS2基因，增强乙酸转化为乙酰辅酶A的能力以解毒乙酸，并考察其对生长的影响。
核心内容
本研究在酿酒酵母中过表达乙酰辅酶A合成酶基因ACS2，以增强乙酸向乙酰辅酶A的转化能力，从而缓解木质纤维素水解液中乙酸对发酵的抑制。结果显示，过表达菌株的ACS2 mRNA水平为对照的4.45倍，酶活性从0.03 U提升至0.14 U。在140 mM乙酸胁迫下，过表达菌株的延滞期由10.37小时缩短至4.63小时，比生长速率从0.20 h⁻¹提高到0.25 h⁻¹，培养48小时后的细胞密度（A600）为2.21，约为对照（0.77）的三倍。无乙酸条件下，过表达菌株生长速率亦提高10%，但延滞期略有增加。额外补充葡萄糖并未增强乙酸耐受性，且高糖浓度下对照菌株产量反而下降。该研究首次直接验证了增强乙酰辅酶A合成能力可有效提高酵母乙酸耐受性的假设，表明ACS2过表达可与其他遗传改造策略联用，为构建耐抑制物的工业菌株提供了可行方案。
创新点
首次直接验证通过增强乙酰辅酶A合成能力提高酵母对外源乙酸耐受性的假设，并量化了过表达对延滞期、生长速率和细胞产量的改善。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae S288c his3Δ | 乙酰辅酶A合成途径（乙酸利用） | ACS2 | Acs2 | 催化 | 通过TEF1启动子在2μ高拷贝质粒pXP420上过表达 |
关键发现
- ACS2 mRNA水平过表达菌株为对照的4.45±0.57倍（p<0.001），乙酰辅酶A合成酶活性为0.14±0.01 vs
- 03±0.01 U（p<0.001）。在140 mM乙酸存在下，过表达菌株延滞期从10.37h缩短至4.63h（约2倍），比生长速率从0.20 h^-1提高至0.25 h^-1（提高25%）。无乙酸时，过表达菌株延滞期增加30%（1.63 vs
- 23h）但生长速率提高10%（0.38 vs
- 34 h^-1）。48h培养后，140 mM乙酸下过表达菌株A600为2.21，对照为0.77（约3倍提高）。在≥160 mM乙酸下两者均几乎不生长。额外补充葡萄糖并未增加乙酸耐受性，在6%和8%葡萄糖下对照菌株产量反而下降（A600从0.77降至0.25和0.07）。
研究结论
ACS2过表达通过增强乙酸消耗促进乙酸解毒，适度提高酿酒酵母的乙酸耐受性，可与其他遗传修饰结合用于构建高产菌株。