Stable heterologous expression of biologically active terpenoids in green plant cells
- 作者
- N. Kusaira B. K. Ikram, Xin Zhan, Xi-Wu Pan, Brian C. King, Henrik T. Simonsen
- 单位
- Department of Plant and Environmental Sciences, Copenhagen Plant Science Centre, University of Copenhagen; Institute of Biological Sciences, Faculty of Science, University of Malaya
- 杂志
- Frontiers in Plant Science（2015）
- DOI
- 10.3389/fpls.2015.00129
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
许多有药用价值的复杂萜类化合物难以通过化学合成获得，微生物宿主表达植物源P450酶等存在困难，急需开发更适合植物源代谢物异源生产的植物表达平台，实现活性萜类在绿色植物细胞中的稳定表达。
研究策略
综述植物表达平台（特别是烟草、拟南芥、小立碗藓）中的萜类代谢工程研究，分析通过调控MVA/MEP途径限速酶、共表达合成酶和P450等策略实现稳定异源生产萜类化合物的案例。
核心内容
该文综述了以绿色植物细胞为底盘异源生产活性萜类化合物的代谢工程策略与研究进展。针对化学合成困难、微生物难以表达植物源P450酶等问题，作者系统梳理了烟草、拟南芥和小立碗藓等植物平台中通过调控MVA/MEP途径限速酶、共表达合成酶及P450酶的案例分析。结果显示，多个植物底盘已实现稳定生产：在烟草中共表达三个青蒿素合成基因后amorpha-4,11-diene产量达4 mg/g鲜重；将倍半萜合成从胞质重定向到质体使产量提高40000倍；黄色番茄中taxadiene达160 mg/kg冻干果；小立碗藓中patchoulol和β-santalene分别达1.3 mg/g和0.039 mg/g干重。关键结果表明，植物平台能进行正确的真核翻译后修饰、具备天然P450系统，且可利用光合作用实现环境友好生产。尽管生长较慢、操作复杂，但随着基因组编辑技术的进步，植物有望成为具有竞争力的“绿色细胞工厂”。
创新点
系统总结了植物细胞作为异源生产平台的优缺点，重点介绍了小立碗藓作为模式生物的优势（同源重组、简单萜类背景、可放大培养），并列举了多个稳定生产小分子萜类的成功实例。
研究对象（26）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Elaeis guineensis | MEP pathway | DXS | 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase | 催化 | 过表达增加β-胡萝卜素含量 |
| Ginkgo biloba | MEP pathway | DXS | 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase | 催化 | 过表达增加银杏内酯含量 |
| Lavandula latifolia | MEP pathway | DXS | 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase | 催化 | 过表达使精油产量增加，叶片3.5倍、花6倍 |
| Salvia sclarea | MEP pathway | DXS | 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase | 催化 | aethiopinone提高2.5倍 |
| Salvia sclarea | MEP pathway | DXR | 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase | 催化 | aethiopinone提高4.6倍 |
| Salvia miltiorrhiza | MEP pathway | DXS | 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase | 催化 | 与GGPPS、HMGR共表达使丹参酮提高4.7倍 |
| Salvia miltiorrhiza | MVA pathway | HMGR | 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase | 催化 | 过表达增加丹参酮积累 |
| Salvia miltiorrhiza | MEP pathway | GGPPS | geranylgeranyl diphosphate synthase | 催化 | 过表达增加丹参酮积累 |
| Nicotiana tabacum | sesquiterpenoid biosynthesis | ADS | amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 表达后产生amorpha-4,11-diene 0.2–1.7 ng/g |
| Nicotiana tabacum | sesquiterpenoid biosynthesis | CYP71AV1 | amorpha-4,11-diene oxidase | 催化 | 共表达后amorpha-4,11-diene达4 mg/g鲜重，artemisinic alcohol 0.01 mg/g干重 |
| Nicotiana benthamiana | sesquiterpenoid biosynthesis | FPS | farnesyl diphosphate synthase | 催化 | 线粒体靶向，与HMGR、ADS共表达 |
| Nicotiana benthamiana | MVA pathway | HMGR | 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase | 催化 | 共表达促进青蒿素前体合成 |
| Nicotiana benthamiana | sesquiterpenoid biosynthesis | CYP71AV1 | amorpha-4,11-diene oxidase | 催化 | 产生artemisinic acid-12-β-diglucoside 39.5 mg/kg鲜重 |
| Nicotiana tabacum | monoterpenoid biosynthesis | GES | geraniol synthase | 催化 | 来自缬草，温室植株产量最高，体外培养降低10倍 |
| Nicotiana tabacum | sesquiterpenoid biosynthesis | PTS | patchoulol synthase | 催化 | 产量0.030 mg/g，挥发物50–100 ng/h；重定向到质体提高40000倍 |
| Arabidopsis thaliana | diterpenoid biosynthesis | TXS | taxadiene synthase | 催化 | taxadiene约20 ng/g干重 |
| Lycopersicon esculentum | diterpenoid biosynthesis | TXS | taxadiene synthase | 催化 | 产生160 mg/kg冻干果实 |
| Physcomitrella patens | diterpenoid biosynthesis | TXS | taxadiene synthase | 催化 | 产生taxadiene且无表型变化 |
| Physcomitrella patens | sesquiterpenoid biosynthesis | PTS | patchoulol synthase | 催化 | 最高产量1.3 mg/g干重 |
| Physcomitrella patens | sesquiterpenoid biosynthesis | STS | santalene synthase | 催化 | α/β-santalene，β-santalene产量0.039 mg/g干重 |
| Physcomitrella patens | MVA pathway | tHMR | truncated 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase | 催化 | 来自自身或酵母，过表达提高patchoulol产量 |
| Physcomitrella patens | diterpenoid biosynthesis | SsLPPS/SsSS | sclareol synthase 1 and 2 | 催化 | sclareol最高2.84 mg/g干重 |
| Artemisia annua | MVA pathway | FPS | farnesyl diphosphate synthase | 催化 | 过表达使青蒿素含量提高3倍 |
| Artemisia annua | MEP pathway | DXR | 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase | 催化 | 与CYP71AV1、CPR共表达提高青蒿素 |
| Artemisia annua | sesquiterpenoid biosynthesis | CYP71AV1 | amorpha-4,11-diene oxidase | 催化 | 青蒿素生物合成关键P450 |
| Artemisia annua | cytochrome P450 redox | CPR | cytochrome P450 reductase | 能量供给 | 为CYP71AV1提供电子 |
关键发现
- 多个植物底盘成功稳定表达活性萜类：烟草中表达amorpha-4,11-diene合酶产生amorpha-4,11-diene产量0.2–1.7 ng/g；共表达三个青蒿素合成基因后amorpha-4,11-diene达4 mg/g鲜重，artemisinic alcohol
- 01 mg/g干重；N. benthamiana瞬时表达产生artemisinic acid-12-β-diglucoside
- 5 mg/kg鲜重；稳定表达缬草香叶醇合酶在温室整体植株中产量最高，体外培养降低10倍；patchoulol在烟草中0.030 mg/g，挥发物50–100 ng/h；将倍半萜合成从胞质重定向到质体使产量提高40000倍；拟南芥表达红豆杉紫杉二烯合酶产生taxadiene约20 ng/g干重；黄色番茄中达160 mg/kg冻干果；小立碗藓中taxadiene产生无表型变化，patchoulol和β-santalene分别达1.3 mg/g和0.039 mg/g干重；sclareol最高达2.84 mg/g干重；过表达截短HMGR增加patchoulol；过表达DXR可提高薄荷精油40%；过表达DXS使熏衣草精油叶片3.5倍、花6倍；过表达FPS使青蒿素提高3倍；Salvia sclarea毛状根中DXS使aethiopinone提高2.5倍，DXR提高4.6倍；丹参中DXS/GGPPS/HMGR使tanshinone提高4.7倍。
研究结论
植物细胞作为异源生产复杂萜类的平台虽然生长慢、操作复杂，但能正确进行真核翻译后修饰、含有天然P450系统，且可利用CO2光合作用，具有环境友好优势。随着基因组编辑技术发展，植物平台将成为有竞争力的‘绿色细胞工厂’。