The Carboxyl-terminal Region of the Geranylgeranyl Diphosphate Synthase is Indispensable for the Stabilization of the Region Involved in Substrate Binding and Catalysis
- 作者
- Yoshihiro Matsumura, Tomohiro Kidokoro, Yukino Miyagi, Navya Rani Marilingaiah, Hiroshi Sagami
- 单位
- Institute of Multidisciplinary Research for Advanced Materials, Tohoku University, 2-1-1 Katahira, Sendai, 980-8577, Japan
- 杂志
- Journal of Biochemistry（2007）
- DOI
- 10.1093/jb/mvm162
- 所属领域
- 蛋白质工程
- 关键词
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解决的核心问题
GGPS的C末端区域对其底物结合和催化活性稳定的作用机制尚不清楚
研究策略
构建大鼠GGPS的一系列C末端缺失突变体，在大肠杆菌中表达，利用类胡萝卜素颜色筛选系统鉴定活性突变体，并通过体外酶动力学分析和产物分析表征突变体的催化性质
研究路线图
核心内容
该研究通过构建大鼠香叶基香叶基二磷酸合酶的一系列C末端缺失突变体，在大肠杆菌中表达并借助类胡萝卜素颜色筛选系统鉴定活性，结合体外酶动力学与产物分析，系统揭示了C末端区域对酶功能维持的关键作用。结果显示，野生型与缺失4、8、12个氨基酸残基突变体的比活比值依次为1.0:0.84:0.26:0.0015，对底物FPP的Km值从0.71 μM分别升至2.0、2.8和55 μM，表明该区域缺失逐渐削弱底物结合与催化效率。缺失8个及以上残基的突变体丧失利用DMAPP和GPP的能力。当缺失达到16个残基时，酶几乎不可溶且活性极低；缺失17个及更多残基则导致体内完全失活，不再产生番茄红素。结论指出，C末端284–300位氨基酸，尤其是285–300位的VALVKHLSKMFTEENE序列，通过稳定底物结合与催化位点的构象，对大鼠GGPS的正常催化功能不可或缺，这一发现为理解异戊二烯转移酶家族的结构稳定性机制提供了重要线索。
创新点
系统揭示GGPS C末端17个氨基酸残基（特别是KMFTEENE序列）对维持活性构象不可或缺，该区域通过稳定底物结合和催化位点来保证GGPS的催化功能
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JM109(DE3) | 类胡萝卜素生物合成 | crtI, crtB | — | 催化 | pACYC-crtIB质粒编码的类胡萝卜素合成酶，用于体内检测GGPS活性（番茄红素产生颜色） |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径（类异戊二烯合成） | 大鼠GGPS（全长及C末端缺失突变体：Δ-0、-4、-8、-12、-16、-17、-18、-19、-20、-23、-57、-70） | 大鼠香叶基香叶基二磷酸合酶（GGPS）及其突变体 | 催化 | GGPS催化FPP与IPP缩合生成GGPP，缺失C末端残基导致底物亲和力下降和活性丧失 |
关键发现
- 野生型GGPS与Δ-4、Δ-8、Δ-12突变体的比活比值为1.0:0.84:0.26:0.0015
- Km(FPP)分别为0.71、2.0、2.8、55 μM
- Km(IPP)分别为2.9、5.1、56、>100 μM
- Δ-16突变体不可溶但活性极低
- Δ-17及更短缺失突变体在体内完全失活（不产生番茄红素）
- Δ-8和Δ-12突变体丧失利用DMAPP和GPP的能力，其GGPP合成活性比值（以FPP为1）分别为0:0.02:1和0:0.03:1
- Δ-0和Δ-4的GGPP合成活性比值为0.02:0.61:1.0和0.02:0.45:1.0
研究结论
大鼠GGPS的C末端区域（284-300位氨基酸，尤其是285-300位的VALVKHLSKMFTEENE）是维持酶活性所必需的，该区域通过稳定底物结合和催化位点的构象来保证GGPS对FPP和IPP的正常催化功能，缺失超过16个氨基酸残基将导致活性丧失