Gene expression studies in kiwifruit and gene over-expression in Arabidopsis indicates that GDP-L-galactose guanyltransferase is a major control point of vitamin C biosynthesis
- 作者
- Sean M. Bulley, Maysoon Rassam, Dana Hoser, Wolfgang Otto, Nicole Schünemann, Michele Wright, Elspeth MacRae, Andrew Gleave, William Laing
- 单位
- Plant and Food Research, PB 92169, Auckland, New Zealand
- 杂志
- Journal of Experimental Botany（2009）
- DOI
- 10.1093/jxb/ern327
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析猕猴桃果实维生素C（L-抗坏血酸，AsA）生物合成的调控机制，确定GDP-L-半乳糖鸟苷酸转移酶（GGT）是否为维生素C生物合成的主要限速控制点。
研究策略
利用定量PCR比较四个猕猴桃基因型（三个种：A. eriantha、A. chinensis、A. deliciosa）在叶片和果实发育过程中AsA含量与L-半乳糖途径、再生和转运相关基因表达的关系；在拟南芥中稳定过表达猕猴桃GGT基因，并在烟草叶片中瞬时共表达GGT和GDP-甘露糖-3',5'-表异构酶（GME），验证GGT的限速作用。
核心内容
该研究以猕猴桃为材料，系统解析了维生素C（L-抗坏血酸，AsA）生物合成的调控机制。研究者比较了三个猕猴桃种（A. eriantha、A. chinensis和A. deliciosa）在叶片和果实发育过程中AsA含量与L-半乳糖途径、再生及转运相关基因表达的关系，并在拟南芥中稳定过表达猕猴桃GGT基因，在烟草叶片中瞬时共表达GGT与GME，验证其限速作用。结果显示，A. eriantha果实AsA浓度约为800 mg/100g鲜重，比其他基因型高3至16倍，且其果实中GME和GGT基因表达水平最高，其中GGT在花后1至6周表达量高出其他基因型2到4倍。在拟南芥中稳定过表达GGT可使叶片AsA水平最高提高4倍；在烟草中瞬时表达GGT单独使AsA提高4.2倍，GME单独仅提高1.2倍，而二者共表达可使AsA平均提高8.6倍，最高达12.4倍。这些结果表明GGT是L-半乳糖途径中维生素C生物合成的主要限速酶，且与GME协同作用能进一步促进AsA积累，为通过育种或转基因策略培育高维生素C植物提供了明确的理论依据。
创新点
首次在猕猴桃中系统分析多个维生素C生物合成途径基因表达与AsA积累的关系；证明GGT是维生素C生物合成的主要控制点；瞬时共表达GGT和GME可使AsA含量提高8.6倍（最多12倍以上）。
研究对象（21）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 猕猴桃（Actinidia eriantha, A. chinensis, A. deliciosa） | L-半乳糖途径（维生素C生物合成） | PMM | 磷酸甘露糖变位酶 (phosphomannomutase) | 催化 | 酶3；早期L-半乳糖途径基因，各基因型间表达相似 |
| 猕猴桃（多个基因型） | L-半乳糖途径（维生素C生物合成） | GMP | GDP-甘露糖焦磷酸化酶 (GDP-mannose pyrophosphorylase) | 催化 | 酶4；A. eriantha中表达显著高于其他基因型 |
| 猕猴桃；烟草（瞬时表达） | L-半乳糖途径（维生素C生物合成） | GME | GDP-甘露糖-3',5'-表异构酶 (GDP-mannose-3',5'-epimerase) | 催化 | 酶5；A. eriantha果实中表达峰值比其他基因型高约70%；单独瞬时表达使烟草AsA提高20%，与GGT共表达显著增加AsA |
| 猕猴桃；拟南芥（稳定过表达）；烟草（瞬时表达） | L-半乳糖途径（维生素C生物合成） | GGT | GDP-L-半乳糖鸟苷酸转移酶 (GDP-L-galactose guanyltransferase) | 催化 | 酶6；关键限速酶；A. eriantha中表达比其他基因型高2-4倍；过表达使拟南芥AsA最高提高4倍，烟草瞬时表达提高4.2倍 |
| 猕猴桃（多个基因型） | L-半乳糖途径（维生素C生物合成） | GPP | L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶 (L-galactose-1-phosphate phosphatase) | 催化 | 酶7；也在肌醇途径中起作用 |
| 猕猴桃（多个基因型） | L-半乳糖途径（维生素C生物合成） | GDH | L-半乳糖脱氢酶 (L-galactose dehydrogenase) | 催化 | 酶8；基因型间表达差异较小 |
| 猕猴桃（多个基因型） | GDP-甘露糖分支-岩藻糖合成 | GMD | GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶 (GDP-D-mannose-4,6-dehydratase) | 催化 | 酶11；A. eriantha中表达较高，可能竞争GDP-D-甘露糖 |
| 猕猴桃（多个基因型） | GDP-甘露糖分支-岩藻糖合成 | GER | GDP-L-岩藻糖合酶 (GDP-L-fucose synthase) | 催化 | 酶12；A. eriantha中表达较高 |
| 猕猴桃（多个基因型） | 半乳糖醛酸途径 | GalUR1 | D-半乳糖醛酸还原酶1 (D-galacturonic acid reductase 1) | 催化 | 酶16；表达与AsA水平无明显关系 |
| 猕猴桃（多个基因型） | 半乳糖醛酸途径 | GalUR2 | D-半乳糖醛酸还原酶2 | 催化 | 成熟叶中表达显著高于幼叶 |
| 猕猴桃（多个基因型） | 半乳糖醛酸途径 | GalUR3 | D-半乳糖醛酸还原酶3 | 催化 | 高水平AsA的Mp097中表达较高 |
| 猕猴桃（多个基因型） | 肌醇途径 | IPS | L-肌醇-1-磷酸合酶 (L-myo-inositol 1-phosphate synthase) | 催化 | 酶18；各基因型表达模式相似 |
| 猕猴桃（多个基因型） | 肌醇途径 | MIOX1 | 肌醇加氧酶1 (myo-inositol oxygenase 1) | 催化 | 酶19；表达模式与其他MIOX不同 |
| 猕猴桃（多个基因型） | 肌醇途径 | MIOX4 | 肌醇加氧酶4 | 催化 | 幼果中表达较高；Mp097在4周花后比Mp212高50% |
| 猕猴桃（多个基因型） | 肌醇途径 | MIOX5 | 肌醇加氧酶5 | 催化 | 仅在部分样品中检测到 |
| 猕猴桃（多个基因型） | 抗坏血酸再生途径 | MDHAR | 单脱氢抗坏血酸还原酶 (monodehydroascorbate reductase) | 催化 | 酶27；A. eriantha中表达高于其他基因型；成熟叶高于幼叶 |
| 猕猴桃（多个基因型） | 抗坏血酸再生途径 | DHAR1 | 脱氢抗坏血酸还原酶1 (dehydroascorbate reductase 1) | 催化 | 酶28；A. deliciosa和A. chinensis中表达高于A. eriantha |
| 猕猴桃（多个基因型） | 抗坏血酸再生途径 | DHAR2 | 脱氢抗坏血酸还原酶2 | 催化 | A. eriantha中表达高于其他基因型 |
| 猕猴桃（多个基因型） | 抗坏血酸氧化 | AO | 抗坏血酸氧化酶 (ascorbate oxidase) | 催化 | 表达峰值出现在花后4-6周，与AsA峰值同步或滞后一周 |
| 猕猴桃（多个基因型） | 抗坏血酸转运 | T1 | 推定抗坏血酸转运蛋白1 (putative nucleobase-ascorbate transporter T1) | 转运 | 幼叶表达高于成熟叶；A. chinensis中表达峰值较高 |
| 猕猴桃（多个基因型） | 抗坏血酸转运 | T2 | 推定抗坏血酸转运蛋白2 (putative nucleobase-ascorbate transporter T2) | 转运 | A. eriantha在花后2-6周表达比其他基因型高3-4倍 |
关键发现
- 果实AsA浓度在花后4-6周达到峰值，A. eriantha的AsA浓度比其他基因型高3-16倍（其鲜果AsA约800 mg/100g FW，其他基因型约50-200 mg/100g）
- A. eriantha成熟叶AsA含量最高为其他基因型的3.5倍，幼叶约10倍
- A. eriantha果实中GDP-甘露糖-3',5'-表异构酶基因（GME）和GDP-L-半乳糖鸟苷酸转移酶基因（GGT）表达量最高，GGT表达在1、4、6周花后比其他基因型高2-4倍
- 在拟南芥中稳定过表达猕猴桃GGT使叶片AsA最高提高4倍
- 烟草瞬时表达GGT单独使AsA提高4.2倍，GME单独提高1.2倍，GGT与GME共表达平均提高8.6倍，最高达12.4倍。
研究结论
GGT是植物L-半乳糖途径维生素C生物合成的主要限速酶，其与GME的共表达可进一步提高AsA含量；基因表达研究证实了GGT和GME在果实AsA含量调控中的重要性，为通过常规育种和转基因手段培育高维生素C植物提供了理论依据。