Acetoacetyl-CoA thiolase regulates the mevalonate pathway during abiotic stress adaptation
- 作者
- Gabriela Soto, Margarita Stritzler, Christian Lisi, Karina Alleva, María Elba Pagano, Fernando Ardila, Matteo Mozzicafreddo, Massimiliano Cuccioloni, Mauro Angeletti, Nicolas Daniel Ayub
- 单位
- Instituto de Genética Ewald A. Favret (CICVyA-INTA); Concejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET); Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires; School of Biosciences and Biotechnology, University of Camerino
- 杂志
- Journal of Experimental Botany（2012）
- DOI
- 10.1093/jxb/err287
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明乙酰乙酰辅酶A硫解酶（MsAACT1）在植物甲羟戊酸（MVA）途径中的调控作用及其在非生物胁迫适应中的生理功能。
研究策略
从苜蓿中克隆MsAACT1基因，通过系统发育分析、异源表达（大肠杆菌和假单胞菌）、酶活性测定、基因表达分析、甲伐他汀抑制剂实验和转基因过表达等方法，研究其在MVA途径和逆境适应中的功能。
核心内容
从苜蓿中克隆了编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶的MsAACT1基因，通过系统发育分析、异源表达、酶活测定及转基因过表达等手段，揭示了该酶在甲羟戊酸（MVA）途径中的调控功能。研究发现MsAACT1受辅酶A反馈抑制，是MVA途径的关键调控节点。在大肠杆菌中异源表达后，硫解酶活性达21±2.6 U/mg蛋白（野生型<0.1 U/mg）；在假单胞菌中表达后，以葡萄糖和葡糖酸为碳源时PHB含量分别达36±5%和57±4%（对照<0.05%），并显著提高重组菌在-20°C和1M NaCl胁迫下的存活率。MsAACT1在根中表达量比叶片高约200倍，低温和盐胁迫5小时后表达显著上调。甲伐他汀抑制试验表明，50μM抑制剂使角鲨烯含量从0.064降至0.006 mg/g干重，而叶绿素和类胡萝卜素水平不变，说明MVA途径特异调控角鲨烯合成。过表达MsAACT1的转基因根在盐胁迫下角鲨烯含量显著增加，HMGR活性不变，植株耐盐性提高。该研究表明乙酰乙酰辅酶A硫解酶通过反馈抑制调节异戊二烯生物合成，在非生物胁迫适应中通过维持抗氧化能力和细胞稳态发挥关键作用，过表达该酶可增强植物耐盐性。
创新点
1. 首次发现植物乙酰乙酰辅酶A硫解酶受CoA反馈抑制，是MVA途径的调控节点；2. 证明MVA途径在非生物胁迫诱导的抗氧化防御中发挥关键作用；3. 过表达MsAACT1在不改变HMGR活性的情况下提高盐胁迫下角鲨烯产量和植株耐盐性。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 苜蓿（Medicago sativa） | 甲羟戊酸（MVA）途径 | MsAACT1 | 乙酰乙酰辅酶A硫解酶（thiolase II） | 催化 | 催化两分子乙酰CoA缩合为乙酰乙酰CoA，是MVA途径第一步，受CoA反馈抑制，在非生物胁迫下表达上调。 |
| 大肠杆菌（Escherichia coli） | MVA途径（异源表达） | MsAACT1 | 乙酰乙酰辅酶A硫解酶 | 催化 | 异源表达用于酶活性测定，野生型活性<0.1 U/mg蛋白，重组菌达21±2.6 U/mg蛋白。 |
| 假单胞菌（Pseudomonas sp. 14-3） | PHB合成途径 | MsAACT1 | 乙酰乙酰辅酶A硫解酶 | 催化 | 功能互补天然硫解酶缺陷突变体，恢复PHB合成，葡萄糖和葡糖酸下PHB含量分别为36±5%和57±4%。 |
| 紫花苜蓿（Medicago sativa） | MVA途径 | HMGR | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | MVA途径公认关键酶，过表达MsAACT1不影响其活性，表明硫解酶是独立调控点。 |
| 拟南芥（Arabidopsis thaliana） | MVA途径 | acat2 | 胞质乙酰乙酰辅酶A硫解酶 | 催化 | 同源基因，用于系统发育和表达模式对比，支持MsAACT1的MVA途径功能。 |
| 向日葵（Helianthus annuus） | β-氧化途径 | 硫解酶II（未命名） | 降解性硫解酶II | 催化 | 系统发育分析将其归类为β-氧化途径降解酶，与合成型硫解酶区分。 |
关键发现
- MsAACT1与蒺藜苜蓿硫解酶II（ACJ84564）有95.6%氨基酸同一性
- 野生型大肠杆菌硫解酶活性<0.1 U/mg蛋白，表达MsAACT1后为21±2.6 U/mg蛋白
- 在假单胞菌14-3中表达MsAACT1后，以葡萄糖和葡糖酸为碳源时PHB含量分别为36±5%和57±4%（对照<0.05%）
- 重组假单胞菌在-20°C和1M NaCl胁迫下存活率显著提高，且添加谷胱甘肽可消除致死效应
- MsAACT1在根中表达量比叶片约高200倍，低温和盐胁迫处理5h后表达显著上调
- 甲伐他汀（50μM）使角鲨烯含量从0.064±0.003降至0.006±0.005 mg/g干重，而叶绿素（1320→1423 mg/g干重）和类胡萝卜素（253→276 mg/g干重）水平无显著变化
- 过表达MsAACT1的转基因根在盐胁迫下角鲨烯含量显著增加，HMGR活性不变，植株耐盐性提高。
研究结论
乙酰乙酰辅酶A硫解酶是MVA途径的一个调控酶，通过CoA反馈抑制调节异戊二烯生物合成，在非生物胁迫适应中通过维持抗氧化能力和细胞稳态发挥关键作用，过表达该酶可提高植物耐盐性。