A barley UDP-glucosyltransferase inactivates nivalenol and provides Fusarium Head Blight resistance in transgenic wheat
- 作者
- Xin Li, Herbert Michlmayr, Wolfgang Schweiger, Alexandra Malachova, Sanghyun Shin, Yadong Huang, Yanhong Dong, Gerlinde Wiesenberger, Susan McCormick, Marc Lemmens, Philipp Fruhmann, Christian Hametner, Franz Berthiller, Gerhard Adam, Gary J. Muehlbauer
- 单位
- Department of Plant and Microbial Biology, University of Minnesota, St. Paul, MN 55108, USA; Department of Applied Genetics and Cell Biology, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna, 3430 Tulln, Austria; Department of Agrobiotechnology, IFA-Tulln, Christian Doppler Laboratory for Mycotoxin Metabolism and Center for Analytical Chemistry, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna, 3430 Tulln, Austria; Department of Agronomy and Plant Genetics, University of Minnesota, St. Paul, MN 55108, USA; Department of Plant Pathology, University of Minnesota, St. Paul, MN 55108, USA; USDA-ARS, Mycotoxin Prevention and Applied Microbiology Research Unit, Peoria, IL 61604, USA; Institute for Biotechnology in Plant Production, Department of Agrobiotechnology, IFA-Tulln, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna, 3430 Tulln, Austria; Institute of Applied Synthetic Chemistry, Vienna University of Technology, 1060 Vienna, Austria
- 杂志
- Journal of Experimental Botany（2017）
- DOI
- 10.1093/jxb/erx109
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
验证大麦UDP-葡萄糖基转移酶HVUGT13248是否能使雪腐镰刀菌烯醇（NIV）失活，并评估其在转基因小麦中对产NIV镰刀菌引起的赤霉病（FHB）的抗性。
研究策略
利用异源表达系统（大肠杆菌、酵母、拟南芥、小麦）研究HVUGT13248对NIV的解毒活性；通过体外酶动力学和翻译抑制试验表征NIV3G的毒性降低；制备NIV3G标准品并建立LC-MS/MS检测方法；通过温室点接种试验评价转基因小麦对产NIV菌株的II型抗性。
核心内容
该研究系统评估了大麦UDP-葡萄糖基转移酶HVUGT13248对雪腐镰刀菌烯醇（NIV）的解毒能力及其在转基因小麦中抗赤霉病的潜力。通过在大肠杆菌、酵母、拟南芥和小麦中异源表达该酶，结合体外酶动力学、翻译抑制实验及LC-MS/MS检测，发现HVUGT13248对NIV的催化效率约为脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）的5倍，其糖基化产物NIV3G对植物和动物核糖体的毒性较NIV降低约300–600倍。表达该酶的酵母可在高达120 mg/L NIV的培养基中生长，转基因小麦在温室点接种试验中赤霉病严重度较对照降低71.1%–90.3%，且穗部NIV和麦角固醇含量显著下降，例如转基因系#8的NIV含量为4.70 mg/L，而对照为29.57 mg/L。此外，利用OsUGT79酶法合成NIV3G标准品（20 mg底物获得16 mg产物）并经NMR确认。研究首次证明HVUGT13248可同时解毒DON和NIV，在转基因小麦中提供广谱II型抗性，为培育抗赤霉病小麦品种提供了优良候选基因。
创新点
首次证明大麦UDP-葡萄糖基转移酶HVUGT13248能高效糖基化NIV并赋予转基因小麦对产NIV镰刀菌的抗性；该酶对NIV的催化效率比DON高约5倍；开发了酶法合成NIV3G标准品的方法，并获得NMR结构确认；揭示了NIV3G对植物和动物核糖体的毒性显著降低（约300-600倍）
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | trichothecene detoxification | HvUGT13248 | HVUGT13248 (nHis6-MalE-HvUGT13248) | 催化 | 重组表达用于酶动力学分析 |
| Saccharomyces cerevisiae | trichothecene detoxification | HvUGT13248 | HVUGT13248 | 催化 | 酵母毒性试验显示能抵抗NIV |
| Arabidopsis thaliana | trichothecene detoxification | HvUGT13248 | HVUGT13248 | 催化 | 转基因拟南芥根生长试验显示NIV抗性 |
| Triticum aestivum | trichothecene detoxification | HvUGT13248 | HVUGT13248 | 催化 | 转基因小麦对NIV产生型F. graminearum具有II型抗性，并能将NIV转化为NIV3G |
| Escherichia coli | trichothecene detoxification | OsUGT79 | OsUGT79 (nHis6-MalE-OsUGT79) | 催化 | 用于制备NIV3G标准品以及动力学比较 |
| Saccharomyces cerevisiae | trichothecene detoxification | AtUGT73C5 | AtUGT73C5 | 催化 | 阴性对照，不能赋予NIV抗性 |
关键发现
- 酵母实验表明，仅表达HvUGT13248的酵母能在含高达120 mg/L NIV的培养基上生长，而AtUGT73C5不能。酶动力学显示，HvUGT13248对NIV的Km为1.2±0.3 mM，Vmax为0.96±0.06 μmol min-1 mg-1，kcat>1.5，kcat/Km>1.3；对DON的Km为3.0±0.6 mM，Vmax为0.49±0.04 μmol min-1 mg-1，kcat>0.78，kcat/Km>0.26，对NIV的催化效率约为DON的5倍。体外翻译抑制实验中，麦胚系统NIV的IC50为0.7 μM，DON为1.6 μM；NIV3G在200 μM时仅抑制约30%，IC20分别为NIV
- 3 μM和NIV3G 90 μM，毒性降低约300倍，兔网织红细胞系统中约600倍。转基因拟南芥在100 mg/L NIV下根长显著长于Col-0。转基因小麦温室试验中，FHB严重度比非转化对照Bobwhite降低71.1%-90.3%；NIV和麦角固醇含量显著下降（如转基因系#8 NIV为4.70 mg/L vs Bobwhite
- 57 mg/L，麦角固醇5.38 mg/L vs
- 53 mg/L）。在NIV处理实验中，转基因系#19在24 h时将62.6%的NIV转化为NIV3G，而Bobwhite仅22.7%；36 h时转化率分别为57.7%和44.5%。此外，利用OsUGT79酶法合成NIV3G，从20 mg NIV获得16 mg NIV3G。
研究结论
HVUGT13248既能解毒DON也能解毒NIV，在转基因小麦中表达可提供对DON型和NIV型镰刀菌的II型抗性，是培育广谱抗赤霉病小麦的优良候选基因。