Cloning and Nucleotide Sequence of the ispA Gene Responsible for Farnesyl Diphosphate Synthase Activity in Escherichia coli
- 作者
- Shingo Fujisaki, Hiroshi Hara, Yukinobu Nishimura, Kensuke Horiuchi, Tokuzo Nishino
- 单位
- Department of Chemistry, Faculty of General Education, Gifu University; National Institute of Genetics, Mishima, Shizuoka; Department of Biochemistry and Engineering, Faculty of Engineering, Tohoku University, Sendai, Miyagi
- 杂志
- Journal of Biochemistry（1990）
- DOI
- 10.1093/oxfordjournals.jbchem.a123327
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并鉴定大肠杆菌中负责法尼基二磷酸合酶（FPP synthase）活性的ispA基因，并确定其核苷酸序列。
研究策略
利用ispA温度敏感突变株，从Kohara等构建的大肠杆菌基因组文库中筛选含10 min区域的λ噬菌体克隆，通过亚克隆、互补实验和酶活性测定定位基因，采用双脱氧链终止法测序，并用maxicell分析鉴定基因产物。
核心内容
该研究克隆并鉴定了大肠杆菌中编码法尼基二磷酸合酶（FPP synthase）的ispA基因，并确定了其核苷酸序列。利用ispA温度敏感突变株，从Kohara基因组文库中筛选λ噬菌体克隆，通过亚克隆、互补实验和酶活性测定定位基因，采用双脱氧链终止法测序，并用maxicell分析鉴定基因产物。测序结果揭示1,452 bp的ispA基因座包含两个开放阅读框，其中ORF-2（编码32,158 Da蛋白）经互补实验证实为ispA基因。表达ispA的质粒pR60使GP407(ispA)菌株在30°C下FPP合酶活性从8.0 pmol/min/mg蛋白提高到458 pmol/min/mg蛋白（约57倍），在40°C下从0.4提高到407 pmol/min/mg蛋白；pR1使JM109活性达582 pmol/min/mg蛋白，为无质粒对照的16.6倍。maxicell分析显示ispA产物表观分子量约36,000。序列比对发现ispA产物与真核FPP合酶及光合细菌crtE产物存在保守氨基酸区域，其中与crtE产物在51残基区有55%一致性，在18残基区有61%一致性。该研究首次报道大肠杆菌ispA基因的克隆与序列，证实其为FPP合酶的结构基因，定位于lon基因逆时针18 kb处，并推测C端附近的保守区对酶功能至关重要，为后续类异戊二烯途径的代谢工程改造奠定了基础。
创新点
首次报道大肠杆菌ispA基因的克隆与序列，发现其编码蛋白与真核FPP合酶及光合细菌crtE产物存在保守氨基酸序列区域，提示该区域在催化中的重要性。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 类异戊二烯/异戊二烯生物合成途径 | ispA（ORF-2） | 法尼基二磷酸合酶（FPP synthase，EC 2.5.1.1） | 催化 | 催化IPP与二甲烯丙基二磷酸或香叶基二磷酸缩合生成法尼基二磷酸；序列长度1,452 bp，编码32,158 Da蛋白，位于lon基因逆时针18 kb处。 |
关键发现
- 克隆并测定了1,452 bp的ispA基因座序列，包含ORF-1（编码8,951 Da蛋白）和ORF-2（编码32,158 Da蛋白）
- 通过互补实验证实ORF-2即ispA基因。表达ispA的质粒pR60使GP407(ispA)菌株在30°C下FPP合酶活性从8.0 pmol/min/mg蛋白提高到458 pmol/min/mg蛋白（约57倍），在40°C下从0.4提高到407 pmol/min/mg蛋白
- pR1使JM109活性达582 pmol/min/mg蛋白（为无质粒对照35的16.6倍）。maxicell分析显示ispA产物表观分子量约36,000。ispA产物与真核FPP合酶及crtE产物存在23残基保守区，与crtE产物另有51残基区55%一致性和18残基区61%一致性。ispA基因位于lon基因逆时针18 kb处。
研究结论
大肠杆菌ispA基因是FPP合酶的结构基因，定位于染色体lon基因逆时针18 kb处；其编码产物与真核FPP合酶及光合细菌crtE产物有同源区域，推测C端附近的保守区对酶功能重要。