Cloning and characterization of AabHLH1, a bHLH transcription factor that positively regulates artemisinin biosynthesis in Artemisia annua
- 作者
- Yunpeng Ji, Jingwei Xiao, Yalin Shen, Dongming Ma, Zhenqiu Li, Gaobin Pu, Xing Li, Lili Huang, Benye Liu, Hechun Ye, Hong Wang
- 单位
- University of Chinese Academy of Sciences; National Institute of Occupational Health and Poison Control, Chinese Center for Disease Control and Prevention; Key Laboratory of Plant Molecular Physiology, Institute of Botany, The Chinese Academy of Sciences; Hebei University
- 杂志
- Plant and Cell Physiology（2014）
- DOI
- 10.1093/pcp/pcu090
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
青蒿素含量低，缺乏对其生物合成调控机制的了解，需要鉴定正向调控青蒿素生物合成的转录因子并阐明其调控机制。
研究策略
从青蒿腺毛cDNA文库中筛选bHLH转录因子，通过RACE获取全长cDNA；分析其表达模式和亚细胞定位；通过EMSA、酵母单杂交和瞬时共转化验证其结合E-box元件并激活ADS和CYP71AV1启动子。
核心内容
该研究从青蒿腺毛cDNA文库中筛选并克隆了bHLH转录因子基因AabHLH1，其开放阅读框长1950 bp，编码650个氨基酸，蛋白分子量约71.83 kDa。通过表达模式分析发现AabHLH1在花中高表达，并受100 μmol/L ABA和150 mg/L壳聚糖快速诱导，亚细胞定位实验证实该蛋白定位于细胞核。电泳迁移率变动实验和酵母单杂交分析表明，AabHLH1能特异结合ADS和CYP71AV1启动子中的E-box元件，突变该元件后结合消失。瞬时共转化实验显示，AabHLH1可使ADS启动子驱动的GUS活性提高约3倍、CYP71AV1启动子驱动的活性提高约2倍；在青蒿叶片中瞬时过表达AabHLH1后，HMGR、ADS和CYP71AV1的转录水平显著上调，而RED1表达下降。上述结果说明AabHLH1通过激活青蒿素合成路径关键酶基因的表达正向调控青蒿素生物合成，可作为提高青蒿素产量的潜在工程靶点。
创新点
首次克隆并表征了青蒿AabHLH1转录因子，证明其作为正向调控因子通过结合ADS和CYP71AV1启动子中的E-box元件激活青蒿素生物合成；发现其响应ABA和壳聚糖诱导；瞬时过表达可上调HMGR、ADS、CYP71AV1并下调RED1。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | AabHLH1 | AabHLH1 (bHLH transcription factor) | 调控 | 转录因子，结合ADS和CYP71AV1启动子中的E-box元件并正向激活其表达 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | ADS | Amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 催化法尼基焦磷酸环化生成amorpha-4,11-diene |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | CYP71AV1 | Cytochrome P450 monooxygenase | 催化 | 催化amorpha-4,11-diene羟基化等多步氧化反应 |
| Artemisia annua | 甲羟戊酸途径 | HMGR | 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase | 催化 | 甲羟戊酸途径限速酶，为青蒿素前体IPP提供合成原料 |
| Artemisia annua | 甲羟戊酸途径/青蒿素前体合成 | FPS | Farnesyl diphosphate synthase | 催化 | 催化IPP和DMAPP缩合生成法尼基焦磷酸(FPP) |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | DBR2 | Artemisinic aldehyde Δ11(13) reductase | 催化 | 催化青蒿醛还原生成二氢青蒿醛 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | ALDH1 | Aldehyde dehydrogenase 1 | 催化 | 催化二氢青蒿醛氧化生成二氢青蒿酸 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | RED1 | Dihydroartemisinic aldehyde reductase | 催化 | 可能负调控青蒿素生物合成，被AabHLH1下调表达 |
| Escherichia coli | 无 | AabHLH1 | AabHLH1 | 调控 | 异源表达用于EMSA蛋白纯化及结合实验 |
关键发现
- AabHLH1 cDNA ORF长1950 bp，编码650个氨基酸，蛋白分子量71.83 kDa，等电点5.75
- AabHLH1在花中高表达、叶和茎中中等表达、根中弱表达
- 100 μmol/L ABA处理30 min内AabHLH1转录水平迅速上升至峰值，1 h后回落
- 150 mg/L壳聚糖处理1 h后AabHLH1被强烈诱导，ADS表达也相应增加
- AabHLH1-GFP融合蛋白定位于细胞核
- EMSA表明重组AabHLH1蛋白（34、54、81、102 ng）与3×E-box探针结合能力递增
- 酵母单杂交显示AabHLH1结合野生型E-box，而突变E-box（m1和m2）后结合消失
- 共转化35S::AabHLH1/ADSpro::GUS的GUS活性约为单独ADSpro::GUS的3倍，35S::AabHLH1/CYP71AV1pro::GUS约为单独CYP71AV1pro::GUS的2倍
- 瞬时表达AabHLH1后ADS、CYP71AV1和HMGR转录水平显著上升，DBR2轻度上升，FPS和ALDH1基本不变，RED1下降
- 突变CYP71AV1启动子两个E-box后GUS活性显著降低（P<0.05）。
研究结论
AabHLH1是一个正调控青蒿素生物合成的bHLH转录因子，通过结合ADS和CYP71AV1启动子中的E-box元件增强其表达，从而促进青蒿素积累，可作为提高青蒿素产量的潜在靶点。