Induction of Terpene Biosynthesis in Berries of Microvine Transformed with VvDXS1 Alleles
- 作者
- Lorenza Dalla Costa, Francesco Emanuelli, Massimiliano Trenti, Paula Moreno-Sanz, Silvia Lorenzi, Emanuela Coller, Sergio Moser, Davide Slaghenaufi, Alessandro Cestaro, Roberto Larcher, Ivana Gribaudo, Laura Costantini, Mickael Malnoy, M. Stella Grando
- 单位
- Research and Innovation Centre, Fondazione Edmund Mach, Genomics and Biology of Fruit Crop Department, San Michele all'Adige, Italy; Center Agriculture Food Environment, University of Trento, San Michele all'Adige, Italy; Research and Innovation Centre, Fondazione Edmund Mach, Computational Biology Platform, San Michele all'Adige, Italy; Technology Transfer Centre, Fondazione Edmund Mach, Experiment and Technological Services Department, San Michele all'Adige, Italy; Institute for Sustainable Plant Protection - CNR, Grugliasco, Italy
- 杂志
- Frontiers in Plant Science（2018）
- DOI
- 10.3389/fpls.2017.02244
- 所属领域
- 植物代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
探究葡萄VvDXS1基因及其K284N突变对单萜和倍半萜生物合成的调控作用，并利用代谢工程手段在microvine模型中提高葡萄香气相关萜类化合物的积累。
研究策略
将VvDXS1的野生型（中性）等位基因和突变型（麝香型，K284N）等位基因分别转入microvine葡萄模型，通过TaqMan阵列定量分析萜类合成相关基因的表达谱，并结合GC-MS定量检测成熟果实中游离态和结合态单萜及倍半萜含量，系统评估MEP途径通量增强对下游萜类代谢的影响。
核心内容
该研究以微葡萄为模型，分别转入葡萄VvDXS1基因的野生型中性等位基因和麝香型K284N突变等位基因，通过TaqMan阵列定量分析83个萜类代谢相关基因的表达，并结合GC-MS检测成熟果实中单萜和倍半萜含量，探究该基因对萜类生物合成的调控作用。结果显示，K284N突变型转化株（Mi-M1）总结合态单萜达2500 μg/kg，为野生型529 μg/kg的4.4倍，而仅过表达野生型基因的Mi-N4为991 μg/kg，野生型的1.7倍；Mi-M1中游离态单萜约500 μg/kg，也显著高于其他株系。值得注意的是，Mi-M1中VvDXS1总表达量仅为Mi-N4的六分之一，但单萜积累更高，表明K284N突变通过提升酶催化效率而非增加转录水平来促进代谢流。此外，转化植株中MEP和MVA途径多个基因以及类胡萝卜素、倍半萜合成基因在花期和转色期显著上调。该工作表明VvDXS1是增强葡萄单萜通量的有效靶点，功能获得性突变比过表达更具优势，且对倍半萜途径也有潜在调控作用。
创新点
['首次在葡萄microvine模型系统中表达不同VvDXS1等位基因并进行功能验证', '开发了基于TaqMan阵列（Aromix）的葡萄萜类代谢基因高通量表达分析工具，覆盖83个靶标基因', '发现VvDXS1基因型对单萜积累具有高预测价值，并首次报道其对倍半萜含量也有影响', '证明K284N突变通过提高酶催化效率比单纯增强VvDXS1表达更能有效促进单萜生物合成']
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 微葡萄（Vitis vinifera cv. microvine 04C023V0006） | MEP途径（甲基赤藓醇磷酸途径） | VvDXS1（等位基因K284N和K284） | 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶（DXS） | 催化 | MEP途径第一个限速酶，K284N突变提高催化效率；也用于葡萄种质资源基因型分析 |
| 微葡萄（Vitis vinifera cv. microvine 04C023V0006） | MEP途径 | HDR（VIT_03s0063g02030） | 羟甲基丁烯基二磷酸还原酶 | 催化 | MEP途径末端酶，在转化植株花期显著上调 |
| 微葡萄（Vitis vinifera cv. microvine 04C023V0006） | MVA途径（甲羟戊酸途径） | AACT（VIT_12s0057g01200） | 乙酰辅酶A酰基转移酶 | 催化 | 在转化植株中强烈上调，表明MEP与MVA途径存在协同调节 |
| 微葡萄（Vitis vinifera cv. microvine 04C023V0006） | MVA途径 | HMGS（VIT_02s0025g04580） | 羟甲基戊二酰辅酶A合酶 | 催化 | MVA途径关键酶，在Mi-N4中显著上调 |
| 微葡萄（Vitis vinifera cv. microvine 04C023V0006） | MVA途径 | HMGR3（VIT_03s0038g04100） | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | MVA途径的重要调控酶，在转化植株中表达上调 |
| 微葡萄（Vitis vinifera cv. microvine 04C023V0006） | 类胡萝卜素生物合成途径 | PSY（VIT_04s0079g00680） | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 类胡萝卜素途径限速酶，观察到只表达一种剪接变体 |
| 微葡萄（Vitis vinifera cv. microvine 04C023V0006） | 类胡萝卜素/脱辅基类胡萝卜素途径 | CCD4（VIT_02s0087g00910） | 类胡萝卜素裂解双加氧酶4 | 催化 | 参与降异戊二烯类香气物质生成，在Mi-N4中显著高于WT |
| 微葡萄（Vitis vinifera cv. microvine 04C023V0006） | 单萜生物合成途径 | OciS（VIT_12s0134g00020） | 罗勒烯合酶 | 催化 | 花器官特异表达的萜烯合酶，在转化植株花期显著上调 |
| 微葡萄（Vitis vinifera cv. microvine 04C023V0006） | 倍半萜生物合成途径 | ValS（VIT_18s0001g04050） | 瓦伦烯合酶 | 催化 | 催化生成瓦伦烯，在转化植株花期显著上调 |
| 微葡萄（Vitis vinifera cv. microvine 04C023V0006） | 倍半萜生物合成途径 | Germacrene D synthase（VIT_18s0001g04280） | 大牻牛儿烯D合酶 | 催化 | 成熟期在Mi-M1中强烈表达 |
关键发现
- 在70个含SNP1822 T等位基因的葡萄品种中，62个总单萜含量高于4 mg/kg，而17个G/G纯合基因型品种均低于1 mg/kg。成熟microvine果实中，Mi-M1（K284N突变型）总结合态单萜为2500 μg/kg，Mi-N4（过表达野生型）为991 μg/kg，Mi-WT为529 μg/kg
- 游离态单萜在Mi-M1中约500 μg/kg，远高于Mi-N4和Mi-WT。Mi-M1和Mi-N4的总单萜含量分别较野生型提高4.4倍和1.7倍，其中游离态和结合态单萜的倍数变化分别为3.2-4.7和1.3-1.9。Mi-M1中VvDXS1总表达量仅为Mi-N4的六分之一，但单萜积累量更高，表明K284N突变增强催化效率是关键因素。此外，转化植株中MEP和MVA途径多个基因（如HDR、AACT、HMGS、HMGR3）在花期和转色期显著上调，类胡萝卜素、单萜和倍半萜合成基因也受到不同程度诱导。
研究结论
VvDXS1是提高葡萄单萜生物合成通量的有效靶点，其K284N功能获得性突变比单纯过表达野生型基因更能显著促进单萜积累，且该基因对倍半萜途径也有潜在调控作用。转基因microvine的萜类代谢途径在转录水平和代谢水平均发生显著扰动，但植物形态和物候未受明显影响。