高级醇 · 代谢工程文献库

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Branch Pathway Blocking in Artemisia annua is a Useful Method for Obtaining High Yield Artemisinin

作者
Zongyou Lv, Fangyuan Zhang, Qifang Pan, Xueqing Fu, Weimin Jiang, Qian Shen, Tingxiang Yan, Pu Shi, Xu Lu, Xiaofen Sun, Kexuan Tang
单位
Joint International Research Laboratory of Metabolic & Developmental Sciences, Key Laboratory of Urban Agriculture (South) Ministry of Agriculture, Plant Biotechnology Research Center, Fudan-SJTU-Nottingham Plant Biotechnology R&D Center, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China
杂志
Plant and Cell Physiology（2016）
DOI
10.1093/pcp/pcw014
所属领域
代谢工程
关键词
AntisenseArtemisia annua LArtemisinin biosynthesisGermacrene A synthase (GAS)Squalene synthase (SQS)β-Caryophyllene synthase (CPS)β-farnesene synthase (BFS)
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解决的核心问题

青蒿素是重要的抗疟药物，但青蒿中天然含量低，且有许多竞争途径分流FPP前体，需要阻断竞争分支途径以提高青蒿素产量。

研究策略

通过外源萜类喷施处理分析分支途径基因与青蒿素途径基因的表达关系，并利用反义RNA技术分别下调CPS、BFS、GAS和SQS基因，结合qRT-PCR和HPLC/GC-MS检测转基因植株中基因表达及代谢物含量的变化。

研究路线图

100%
研究问题：青蒿素含量低，分支途径分流FPP前体
策略：反义RNA下调CPS/BFS/GAS/SQS
关键改造①：anti-CPS（β-石竹烯合酶↓74%）
关键改造②：anti-BFS（β-法尼烯合酶↓13-40%）
关键改造③：anti-GAS（大根香叶烯A合酶↓11-26%）
关键改造④：anti-SQS（角鲨烯合酶显著降低）
结果：青蒿素+77%~103%，DHAA+54%~223%，途径基因（ADS/CYP71AV1）上调3-6倍
结论：分支途径抑制（尤其BFS/SQS）重定向碳流入青蒿素合成，联合过表达ADS可增效
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核心内容

该研究以青蒿为对象，系统考察了反义抑制四个竞争分支途径基因（CPS、BFS、GAS、SQS）对青蒿素生物合成的影响。通过外源萜类喷施实验分析分支途径与青蒿素途径基因的表达关系，并利用反义RNA技术分别下调目标基因，结合qRT-PCR和HPLC/GC-MS检测转基因植株的基因表达及代谢物含量。结果显示，抑制CPS使β-法尼烯、青蒿素和双氢青蒿酸分别提高212%、77%和132%；抑制BFS使青蒿素和双氢青蒿酸提高77%和54%；抑制GAS使两者分别提高103%和130%；抑制SQS使青蒿素和双氢青蒿酸提高71%和223%。外源喷施实验表明不同萜类可交叉调控分支途径基因，且转基因植株中ADS表达通常增加3-6倍。该研究证明反义抑制BFS或SQS能有效重定向碳流进入青蒿素合成途径，显著提高青蒿素产量，联合抑制分支基因与过表达ADS可能是进一步提升产量的有效策略。

创新点

['首次系统比较抑制CPS、BFS、GAS和SQS四个分支途径基因对青蒿素生物合成的影响', '首次证明抑制BFS或SQS能显著上调青蒿素生物合成途径基因并提高青蒿素含量', '采用反义方法避免RNAi可能引起的早花和生物量下降等副作用']

研究对象（8）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Artemisia annua L. 萜类代谢（青蒿素生物合成与竞争分支） CPS β-石竹烯合酶 催化 分支途径酶，通过反义技术下调表达，反义植株中CPS表达下降74%
Artemisia annua L. 萜类代谢（青蒿素生物合成与竞争分支） BFS β-法尼烯合酶 催化 分支途径酶，通过反义技术下调表达，反义植株中BFS表达下降13-40%
Artemisia annua L. 萜类代谢（青蒿素生物合成与竞争分支） GAS 大根香叶烯A合酶 催化 分支途径酶，通过反义技术下调表达，反义植株中GAS表达下降11-26%
Artemisia annua L. 萜类代谢（青蒿素生物合成与竞争分支） SQS 角鲨烯合酶 催化 分支途径酶，通过反义技术下调表达，反义植株中SQS表达显著降低
Artemisia annua L. 青蒿素生物合成途径 ADS 紫穗槐二烯合酶 催化 青蒿素途径关键酶，在多种反义转基因植株中表达上调3-6倍
Artemisia annua L. 青蒿素生物合成途径 CYP71AV1 紫穗槐二烯12-羟化酶 催化 细胞色素P450单加氧酶，在anti-BFS和anti-SQS等植株中表达上调
Artemisia annua L. 青蒿素生物合成途径 DBR2 青蒿醛Δ11(13)还原酶 催化 在大多数转基因植株中表达变化很小
Artemisia annua L. 青蒿素生物合成途径 ALDH1 醛脱氢酶1 催化 参与DHAA合成，在多种反义转基因植株中表达上调

关键发现

  1. 在anti-CPS转基因青蒿中，β-法尼烯、青蒿素和双氢青蒿酸(DHAA)含量分别提高212%、77%和132%
  2. anti-BFS植株中青蒿素和DHAA含量分别提高77%和54%，角鲨烯含量提高235%
  3. anti-GAS植株中青蒿素和DHAA含量分别提高103%和130%
  4. anti-SQS植株中青蒿素和DHAA含量分别提高71%和223%，β-法尼烯含量提高123%。外源喷施β-石竹烯抑制CPS表达并上调BFS、GAS、CYP71AV1、DBR2、ALDH1
  5. 喷施β-法尼烯抑制BFS，使CPS和CYP71AV1表达上调3倍和5倍
  6. 喷施角鲨烯抑制SQS，使多数途径基因表达上调2-5倍。在转基因植株中ADS表达通常增加3-6倍，而DBR2表达变化很小（1-2倍）。

研究结论

通过反义抑制分支途径基因（特别是BFS和SQS）可有效重定向碳流进入青蒿素生物合成途径，显著提高青蒿素含量；同时联合抑制BFS或SQS与过表达ADS可能是进一步提高青蒿素产量的有效策略。