Improved folding of apo-retinol-binding protein in the periplasm of Escherichia coli: positive influences of dsbC coexpression and of an amino acid exchange in the vitamin A binding site
- 作者
- André M.Schmidt, Ingrid Bloß, Arne Skerra
- 单位
- Institut für Biochemie, Technische Universität, Petersenstraße 22, D-64287 Darmstadt, Germany
- 杂志
- Protein Engineering（1998）
- DOI
- 10.1093/protein/11.7.601
- 所属领域
- 蛋白质工程
- 关键词
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解决的核心问题
重组apo-RBP在大肠杆菌周质中折叠效率低，产生非天然二硫键异构体，产量低
研究策略
共表达二硫键异构酶DsbC以促进正确二硫键形成；基于分子建模设计Gln117→Ile突变以改善折叠效率
研究路线图
核心内容
该研究针对重组apo-视黄醇结合蛋白（RBP）在大肠杆菌周质中因非天然二硫键形成而折叠效率低的问题，采用共表达二硫键异构酶DsbC并结合分子建模指导的氨基酸定点突变来优化折叠途径。结果显示，DsbC共表达使可溶性RBP产量较对照增加约2倍，且彻底消除了非天然二硫键异构体，总产量在提高细胞密度后可达5倍。基于结合口袋设计的Gln117→Ile疏水替换进一步使功能性RBP产量提升3倍以上，单位细胞产量从野生型的282±61 μg/(L·OD550)升至880±26 μg/(L·OD550)，同时突变体对视黄醇的亲和力增强，Kd从94±9 nM降至58±7 nM，结合速率常数相应提高，而解离速率基本不变。双突变体I117/W104则因空间位阻导致亲和力显著下降至675±32 nM，印证了该位点的关键作用。该工作表明，通过协同运用辅助蛋白共表达和结合位点理性设计，可有效改善脂质运载蛋白家族的体内折叠效率，为同类含二硫键天然蛋白的高效重组表达提供了可行策略。
创新点
发现单个氨基酸替换(Gln117→Ile)能显著提高RBP的体内折叠产量；利用dsbC共表达消除非天然二硫键异构体而不需外加还原剂
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JM83 | 二硫键形成/蛋白质折叠 | dsbC | DsbC | 催化 | 周质硫醇-二硫键氧化还原酶/二硫键异构酶，共表达促进RBP正确二硫键形成 |
| Escherichia coli JM83 | 视黄醇结合与转运 | RBP | RBP/H3(A)及突变体I117, I117/W104 | 转运 | 目标重组蛋白；Gln117→Ile突变位于配体结合口袋，提高折叠效率 |
关键发现
- DsbC共表达使可溶性RBP产量增加约2倍（相对于不含dsbC的对照），并消除非天然二硫键异构体
- 总产量因细胞密度提高可增加至5倍。Gln117→Ile突变使功能性RBP产量提高3倍以上：野生型RBP/H3(A)产量为282±61 μg/(L·OD550)，突变体I117为880±26 μg/(L·OD550)。突变体对retinol的Kd从94±9 nM降低到58±7 nM，kon从12.7±4.0 mM^-1 s^-1增加到19.6±5.3 mM^-1 s^-1，koff基本不变。双突变体I117/W104的Kd升至675±32 nM。
研究结论
通过共表达DsbC和引入疏水性氨基酸替换，可以显著优化脂质运载蛋白的折叠途径，提高功能性蛋白产量，表明蛋白质工程可改善天然蛋白的折叠效率。