Squalene-hope ne cycle from Bradyrhizobium japonicum: cloning, expression, sequence analysis and comparison to other triterpenoid cyclases
- 作者
- Michael Perzl, Peter Muller, Karl Poralla, Elmar L. Kannenberg
- 单位
- Mikrobiologie/Biotechnologie, Universitat Tubingen, Auf der Morgenstelle 1, D-72076 Tubingen, Germany; Fachbereich BiologieBotanik, Universitat Marburg, Lahnberge, D-35043 Marburg, Germany; Complex Carbohydrate Research Center and Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 220 Riverbend Road, Athens, GA 30602-4712, USA
- 杂志
- Microbiology（1997）
- DOI
- 10.1099/00221287-143-4-1235
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并表征大豆慢生根瘤菌中编码鲨烯-藿烯环化酶(SHC)的基因，研究其序列、表达及与其他三萜环化酶的关系。
研究策略
基于PCR筛选方法从粘粒文库中分离shc基因，进行DNA测序和序列分析，并在大肠杆菌中异源表达，通过体外酶活测定验证其催化功能。
核心内容
本研究从大豆慢生根瘤菌USDA 110中克隆并表征了编码鲨烯-藿烯环化酶（SHC）的shc基因。通过基于PCR的筛选方法从粘粒文库中分离该基因，经DNA测序后进行序列分析，并在大肠杆菌DH5α中异源表达重组蛋白，通过体外酶活测定验证其催化功能。shc基因全长1983 bp，编码660个氨基酸，预测分子量约73.7 kDa。序列比较显示，该蛋白与运动发酵单胞菌的SHC一致性达59%，与嗜酸脂环芽孢杆菌等原核环化酶一致性约38%，与真核氧化鲨烯环化酶一致性为38–43%。体外酶活实验表明，重组SHC能将约20%的鲨烯转化生成藿烯和二倍角鲨烯醇，其中藿烯产量约为二倍角鲨烯醇的5倍，但未检测到四氢膜醇的生成，提示该菌株可能存在第二个鲨烯环化酶或需要特定膜环境完成此反应。此外，shc基因上游发现一个与shc有13 bp重叠的部分开放阅读框ORF1'，与运动发酵单胞菌shc上游ORF的C端具有51%的一致性，提示两者可能形成共转录操纵子。这些结果首次证明了大豆慢生根瘤菌SHC的催化功能，为理解原核三萜环化酶的进化与hopanoid生物合成调控提供了基础。
创新点
首次从Bradyrhizobium japonicum中克隆了shc基因；发现其与Zymomonas mobilis的SHC高度同源；重组SHC在大肠杆菌中成功表达并催化鲨烯环化生成藿烯和二倍角鲨烯醇，但不能生成四氢膜醇，提示可能存在第二个鲨烯环化酶。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bradyrhizobium japonicum USDA 110 | hopanoid生物合成 | shc | 鲨烯-藿烯环化酶 (SHC) | 催化 | 从该菌株克隆的shc基因，编码环化鲨烯生成藿烯和二倍角鲨烯醇的酶 |
| Escherichia coli DH5α | 异源表达 | shc | 重组鲨烯-藿烯环化酶 (SHC) | 催化 | 作为表达宿主，重组SHC在体外可催化鲨烯生成藿烯和二倍角鲨烯醇 |
关键发现
- shc基因长1983 bp，编码660个氨基酸，预测分子量73671 Da
- 该蛋白与Z. mobilis SHC相似性70%（一致性59%），与Alicyclobacillus acidocaldarius和A. acidoterrestris SHC相似性48%（一致性38%），与真核生物氧化鲨烯环化酶相似性38-43%
- 重组SHC在体外将约20%的鲨烯转化为产物，其中藿烯产量约为二倍角鲨烯醇的5倍
- shc基因GC含量为64.8%
- 上游0.5 kb区域发现部分ORF（ORF1'，163个氨基酸），与Z. mobilis shc上游ORF的C端有64%相似性、51%一致性，且ORF1'与shc有13 bp重叠，提示可能形成操纵子。
研究结论
成功克隆并表达了大豆慢生根瘤菌USDA 110的shc基因，证明其编码的SHC具有催化鲨烯环化生成藿烯和二倍角鲨烯醇的活性，但不能生成四氢膜醇，表明B. japonicum可能存在第二个鲨烯环化酶或需要特定膜环境才能合成四氢膜醇。序列分析还提示shc可能与其上游ORF共转录。