A novel carotenoid 1,2-hydratase (CruF) from two species of the non-photosynthetic bacterium Deinococcus
- 作者
- Zongtao Sun, Shaochuan Shen, Chao Wang, Hu Wang, Yaping Hu, Jiandong Jiao, Tingting Ma, Bing Tian, Yuejin Hua
- 单位
- Key Laboratory for Nuclear-Agricultural Sciences of Chinese Ministry of Agriculture and Zhejiang Province, Institute of Nuclear-Agricultural Sciences, Zhejiang University; State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry Synthesis Technology, College of Chemical Engineering and Materials Science, Zhejiang University of Technology
- 杂志
- Microbiology（2012）
- DOI
- 10.1099/mic.0.027623-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在非光合细菌Deinococcus radiodurans和Deinococcus geothermalis中鉴定编码类胡萝卜素1,2-水合酶的基因，并阐明deinoxanthin生物合成中C-1',2'水合步骤的酶学基础。
研究策略
通过比较基因组学在crtO基因邻域筛选候选基因dr0091和dgeo2309；在E. coli中异源表达这些基因并利用产neurosporene、lycopene或γ-胡萝卜素的质粒进行底物特异性分析；通过同源重组构建dr0091敲除突变株并分析类胡萝卜素组成；利用系统发育分析揭示CruF与CrtC的进化关系。
核心内容
该研究在非光合细菌Deinococcus radiodurans和D. geothermalis中鉴定并表征了新型类胡萝卜素1,2-水合酶CruF，阐明了deinoxanthin生物合成中C-1',2'水合步骤的酶学基础。通过比较基因组学在crtO基因邻域筛选出候选基因dr0091和dgeo2309，在E. coli中异源表达并利用不同类胡萝卜素底物进行功能验证，同时构建了dr0091基因敲除突变株进行分析。结果显示，dr0091和dgeo2309编码的CruF蛋白序列一致性为63%，异源表达后能将neurosporene转化为1-OH-neurosporene（556 Da）和1,1'-(OH)2-neurosporene（574 Da），也能水合lycopene和γ-胡萝卜素。敲除突变株呈粉红色，积累2-hydroxy-4-keto-γ-carotene（566 Da）而丧失deinoxanthin，证实水合反应是CrtD催化的C-3',4'脱氢反应的前提。系统发育分析表明CruF与已知CrtC型水合酶形成独立进化分支。该发现首次在非光合细菌中鉴定此类酶，为工程化生产高活性类胡萝卜素提供了新元件。
创新点
['首次在非光合细菌中鉴定并功能验证了新型类胡萝卜素1,2-水合酶CruF', '证明CruF与已知的CrtC型水合酶进化距离远，形成独立家族', "揭示了deinoxanthin生物合成中水合反应先于CrtD催化的C-3',4'脱氢反应"]
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Deinococcus radiodurans R1 | deinoxanthin生物合成 | dr0091 (cruF) | CruF (DR0091) | 催化 | 经基因表达和敲除实验确认的类胡萝卜素1,2-水合酶，催化γ-胡萝卜素C-1',2'水合 |
| Deinococcus geothermalis DSM 11300 | 类胡萝卜素生物合成 | dgeo2309 (cruF) | CruF (Dgeo2309) | 催化 | 与DR0091同源的1,2-水合酶，异源表达验证其功能 |
| Escherichia coli DH5α | 异源类胡萝卜素合成 | dr0091/dgeo2309 | CruF | 催化 | 作为异源表达宿主，验证CruF对neurosporene、lycopene和γ-胡萝卜素的水合活性 |
| Deinococcus radiodurans R1 (R1ΔcruF突变株) | deinoxanthin生物合成 | dr0091 (cruF) | 无（基因敲除） | 催化 | 敲除后阻断C-1',2'水合，积累2-hydroxy-4-keto-γ-carotene、4-keto-γ-carotene和γ-carotene |
| Deinococcus radiodurans R1 | deinoxanthin生物合成 | dr2250 (crtD) | CrtD | 催化 | 类胡萝卜素3',4'-脱饱和酶，其催化需先经CruF水合 |
关键发现
- dr0091和dgeo2309编码CruF，DR0091与Dgeo2309氨基酸序列一致性为63%，与Synechococcus sp. PCC 7002的CruF一致性为35%。异源表达dr0091或dgeo2309在产neurosporene的E. coli中生成1-OH-neurosporene（556 Da）和1,1'-(OH)2-neurosporene（574 Da）
- 在产lycopene的E. coli中生成1-OH-lycopene（554 Da）和1,1'-(OH)2-lycopene（572 Da）
- 在产γ-胡萝卜素的E. coli中生成1'-OH-γ-胡萝卜素（554 Da）。D. radiodurans dr0091敲除突变株（R1ΔcruF）呈粉红色，积累2-hydroxy-4-keto-γ-carotene（566 Da）、4-keto-γ-carotene（550 Da）和γ-胡萝卜素，而野生型主要积累deinoxanthin。系统发育分析显示CruF同源物形成独立于CrtC的进化分支。
研究结论
本研究鉴定并表征了非光合细菌D. radiodurans和D. geothermalis中的新型类胡萝卜素1,2-水合酶CruF，该酶催化deinoxanthin生物合成中γ-胡萝卜素的C-1',2'水合，且其催化的水合反应是CrtD进行C-3',4'脱氢的前提。CruF同源物在进化上形成一个独立于CrtC的家族，可能经侧向基因转移而分布。该酶对deinoxanthin的抗氧化活性至关重要，也为基因工程生产高活性类胡萝卜素提供了新元件。