A constitutively expressed pair of rpoE2-chrR2 in Azospirillum brasilense Sp7 is required for survival under antibiotic and oxidative stress
- 作者
- Namrata Gupta, Santosh Kumar, Mukti Nath Mishra, Anil Kumar Tripathi
- 单位
- School of Biotechnology, Faculty of Science, Banaras Hindu University, Varanasi-221005, India
- 杂志
- Microbiology（2012）
- DOI
- 10.1099/mic.0.061937-0
- 所属领域
- 微生物学
- 关键词
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解决的核心问题
在巴西固氮螺菌Sp7中，第二个ECF sigma因子/抗sigma因子对RpoE2-ChrR2在氧化胁迫和抗生素压力下的作用与调控机制未知，本研究对其进行了表征。
研究策略
利用生物信息学、基因敲除、过表达、启动子-lacZ融合、双重杂交和pull-down分析、蛋白质组学（2D凝胶电泳结合MALDI-TOF/TOF）等方法，研究rpoE2-chrR2的转录共表达、蛋白互作、启动子调控、表型效应及下游调控基因。
研究路线图
核心内容
该研究以巴西固氮螺菌Sp7为对象，表征了第二个ECF sigma因子/抗sigma因子对RpoE2-ChrR2的功能与调控机制。通过启动子-lacZ融合分析发现，rpoE2启动子在无胁迫条件下的活性比rpoE1启动子高35%-40%，且呈现组成型表达，缺乏自调控。基因敲除和过表达实验表明，chrR2失活或rpoE2过表达导致类胡萝卜素过量产生，并使菌株对亚甲蓝、百草枯等氧化剂以及氨曲南、头孢克肟、头孢噻肟等β-内酰胺类抗生素和萘啶酸产生抗性。蛋白质组学鉴定出25个上调蛋白，其中fasciclin域蛋白上调61倍，GTP环化水解酶I上调7倍。双重杂交和pull-down实验证实RpoE2与ChrR2在体内外均能物理互作。该发现首次报道革兰氏阴性菌中存在两个ZAS家族抗sigma因子，揭示了RpoE2通过控制类胡萝卜素合成、翻译、蛋白折叠和嘌呤修复等途径快速响应氧化胁迫并赋予抗生素抗性，其缺乏自调控有利于快速响应单线态氧介导的胁迫。
创新点
首次报道革兰氏阴性菌中存在两个ZAS家族抗sigma因子（ChrR1和ChrR2）；发现rpoE2-chrR2组成型表达且缺乏自调控，与rpoE1-chrR1不同；揭示RpoE2通过控制类胡萝卜素合成、翻译起始/延伸、蛋白折叠和嘌呤修复等途径快速响应氧化胁迫，并赋予抗生素抗性。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Azospirillum brasilense Sp7 | 氧化应激响应/类胡萝卜素生物合成 | rpoE2 | RpoE2 | 调控 | ECF sigma因子，与ChrR2结合被抑制，释放后驱动靶基因转录 |
| Azospirillum brasilense Sp7 | 氧化应激响应/类胡萝卜素生物合成 | chrR2 | ChrR2 | 调控 | ZAS家族抗sigma因子，与RpoE2形成复合物，抑制其活性 |
| Azospirillum brasilense Sp7 | 氧化应激响应 | rpoE1 | RpoE1 | 调控 | 第一个ECF sigma因子，受自调控，与RpoE2功能冗余但调控机制不同 |
| Azospirillum brasilense Sp7 | 氧化应激响应 | chrR1 | ChrR1 | 调控 | 第一个ZAS抗sigma因子，对应RpoE1 |
| Azospirillum brasilense Sp7 | 氧化应激响应/抗氧化防御 | ahpC (AZOBR_p1130169) | AhpC（烷基氢过氧化物还原酶C亚基） | 催化 | RpoE2过表达时上调2.4倍，清除过氧化物 |
| Azospirillum brasilense Sp7 | 营养转运 | modA (AZOBR_p1150017) | ModA（钼ABC转运蛋白） | 转运 | RpoE2过表达时上调2.1倍，参与钼离子转运 |
| Azospirillum brasilense Sp7 | 能量代谢 | atpA (AZOBR_40304) | AtpA（ATP合酶α亚基） | 能量供给 | RpoE2过表达时上调2.0倍，提供ATP以应对胁迫 |
关键发现
- rpoE2启动子活性在无胁迫条件下比rpoE1启动子高35%-40%
- chrR2失活或rpoE2过表达导致类胡萝卜素过量产生，且对亚甲蓝、百草枯等氧化剂及氨曲南、头孢克肟、头孢噻肟等β-内酰胺类抗生素和萘啶酸产生抗性
- 蛋白质组学鉴定出25个上调蛋白，其中fasciclin域蛋白上调61倍，GTP环化水解酶I上调7倍，乙酰-CoA乙酰转移酶上调3.5倍，50S核糖体蛋白L9上调3.0倍，烷基氢过氧化物还原酶上调2.4倍，ATP依赖性Clp蛋白酶上调2.4倍，Mo转运蛋白上调2.1倍，GroEL上调2.0倍等
- RpoE2与ChrR2在体内外均能物理互作。
研究结论
RpoE2-ChrR2是组成型表达的功能性ECF sigma/抗sigma因子对，通过类胡萝卜素合成和多种修复机制保护细胞免受氧化损伤，并赋予抗生素抗性；其缺乏自调控有利于快速响应单线态氧介导的胁迫。