Isolation and Characterization of Two Germacrene A Synthase cDNA Clones from Chicory
- 作者
- Harro J. Bouwmeester, Jan Kodde, Francel W.A. Verstappen, Iris G. Altug, Jan-Willem de Kraker, T. Eelco Wallaart
- 单位
- Plant Research International, Business Unit Cell Cybernetics, P.O. Box 16, 6700 AA Wageningen, The Netherlands; Department of Organic Chemistry, Hamburg University, D-20146 Hamburg, Germany; Department of Organic Chemistry, Wageningen Agricultural University, Dreijenplein 8, 6703 HB Wageningen, The Netherlands; University Centre for Pharmacy, Department of Pharmaceutical Biology, University of Groningen, Antonius Deusinglaan 1, 9713 AV Groningen, The Netherlands
- 杂志
- Plant Physiology（2002）
- DOI
- 10.1104/pp.001024
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并鉴定菊苣中参与倍半萜内酯生物合成的(+)-germacrene A合酶基因，揭示其表达和酶学特性。
研究策略
利用简并引物PCR从菊苣cDNA中扩增倍半萜合酶片段，筛选cDNA文库获得全长基因；在大肠杆菌中异源表达，通过放射性GC和GC-MS鉴定产物为(+)-germacrene A；通过Northern blot分析表达模式，通过MonoQ层析和酶动力学表征酶学性质；通过同源建模比较活性位点差异。
研究路线图
核心内容
该研究从菊苣中克隆并鉴定了两个编码(+)-germacrene A合酶的cDNA克隆CiGASsh和CiGASlo，分别编码558和583个氨基酸，预测分子量64.4 kDa和67.1 kDa，两者氨基酸序列一致性为72%。通过在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，两个重组蛋白均特异催化法尼基焦磷酸生成(+)-germacrene A，并经放射性GC和GC-MS确认。酶动力学分析显示，CiGASsh的Km为3.2 μM、Vmax为21.5 pmol h−1 μg−1，CiGASlo的Km为6.9 μM、Vmax为13.9 pmol h−1 μg−1，最适pH分别为7.0和6.8。Northern blot表明两基因在菊苣不同组织中表达模式显著差异，CiGASsh在根中高表达，CiGASlo则在外根组织中表达最强；MonoQ层析进一步证实头状花序中天然存在两个GAS蛋白。分子建模与烟草5-epi-aristolochene合酶比较显示，GAS中Tyr-520的空间取向及Tyr-527被Phe取代可能是决定产物特异性的关键。该工作揭示了菊苣倍半萜内酯生物合成中两个同工酶的分工，为后续通过定点突变改造产物特异性提供了重要基础。
创新点
首次分离了编码(+)-germacrene A合酶的cDNA；发现两个低同源性的同工酶基因；通过分子建模和与TEAS比较，指出了可能决定产物特异性的关键氨基酸残基。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜内酯生物合成途径 | CiGASsh | germacrene A synthase (GAS) | 催化 | 催化FDP环化生成(+)-germacrene A，Km=3.2μM，最适pH7.0 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜内酯生物合成途径 | CiGASlo | germacrene A synthase (GAS) | 催化 | 催化FDP环化生成(+)-germacrene A，Km=6.9μM，最适pH6.8 |
关键发现
- 从菊苣中分离到两个编码(+)-germacrene A合酶的cDNA克隆CiGASsh和CiGASlo，分别编码558和583个氨基酸，预测分子量64.4 kDa和67.1 kDa，pI分别为4.89和5.19，氨基酸序列一致性72%。异源表达于大肠杆菌BL21(DE3)后，两者均特异催化FDP生成(+)-germacrene A。酶动力学数据显示：CiGASsh的Km为3.2 μM，Vmax为21.5 pmol h−1 μg−1
- CiGASlo的Km为6.9 μM，Vmax为13.9 pmol h−1 μg−1
- 最适pH分别为7.0和6.8。Northern blot显示两基因在不同组织中表达差异显著，CiGASsh在根中高表达，CiGASlo在外根组织中表达最强。MonoQ层析证实菊苣头状花序中存在两个GAS蛋白，其洗脱峰与重组蛋白一致。分子建模显示，与烟草5-epi-aristolochene合酶（TEAS）相比，GAS中Tyr-520位置的空间取向不同，且Tyr-527被Phe取代，可能决定了产物终止于germacrene A。
研究结论
成功克隆了菊苣中两个GAS同工酶基因，证明两者均产生(+)-germacrene A。表达和酶学特征表明它们在菊苣倍半萜内酯生物合成中发挥不同作用。通过分子建模和与TEAS的比较，提出了影响产物特异性的关键氨基酸残基，为后续通过定点突变改造产物特异性奠定了基础。