Expression and Molecular Analysis of the Arabidopsis DXR Gene Encoding 1-Deoxy-D-Xylulose 5-Phosphate Reductoisomerase, the First Committed Enzyme of the 2-C-Methyl-D-Erythritol 4-Phosphate Pathway
- 作者
- Lorenzo Carretero-Paulet, Ivan Ahumada, Nuria Cunillera, Manuel Rodríguez-Concepción, Albert Ferrer, Albert Boronat, Narciso Campos
- 单位
- Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Facultat de Química, Universitat de Barcelona, C/Martí i Franques 1, 08028 Barcelona, Spain; Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Facultat de Farmacia, Universitat de Barcelona, Avinguda Diagonal 643, 08028 Barcelona, Spain
- 杂志
- Plant Physiology（2002）
- DOI
- 10.1104/pp.003798
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析拟南芥中编码MEP途径第一个限速酶DXR的基因表达模式和分子特性，并探讨其在MEP途径调控中的作用。
研究策略
通过5'-RACE克隆全长cDNA，进行序列分析和比较；利用GFP融合和免疫电镜确定亚细胞定位；通过大肠杆菌dxr突变体互补验证功能；通过Northern/Western blot、启动子-GUS报告基因及fosmidomycin抑制实验分析表达调控。
研究路线图
核心内容
该研究以拟南芥为对象，系统解析了MEP途径第一个限速酶DXR的基因表达模式与分子特性。通过5'-RACE克隆获得全长cDNA并完成序列分析，利用GFP融合和免疫电镜实验直接证明DXR蛋白定位于叶绿体，首次为植物DXR的质体定位提供了实验证据。大肠杆菌dxr突变体互补实验表明，表达包含57至477残基的AtDXR-L可使菌落恢复至2至3毫米，而缺失更多N端残基的AtDXR-S互补能力明显减弱，提示该区域对酶活性至关重要。研究发现拟南芥DXR由单拷贝基因编码，位于5号染色体，含12个外显子，编码477个氨基酸的蛋白，其N端含质体转运肽和一段植物特有的脯氨酸富集区。表达分析显示DXR转录本在幼苗和花序中高水平积累，受光诱导显著上调；100 μM fosmidomycin处理7天幼苗后1小时，DXR蛋白急剧积累而DXS不变，说明DXR受到独立的代谢调控。DXR-GUS表达模式与DXS平行但在茎和根中更受限。这些结果揭示了DXR在MEP途径中作为调控节点的角色，其表达受发育和光信号双重调节。
创新点
首次提供植物DXR质体定位的直接实验证据；揭示植物DXR特有的N端脯氨酸富集区；证明DXR基因表达与DXS平行但范围更受限，并发现DXR蛋白受代谢调控快速积累。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 拟南芥（Arabidopsis thaliana） | MEP途径（2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸途径） | DXR | DXR（1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶） | 催化 | 催化DXP转化为MEP，是MEP途径的第一个限速酶；定位于质体/叶绿体；单拷贝基因编码 |
| 拟南芥（Arabidopsis thaliana） | MEP途径（2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸途径） | DXS | DXS（1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶） | 催化 | 催化MEP途径的第一步反应，与DXR表达模式平行但范围更广 |
| 大肠杆菌（Escherichia coli） | MEP途径（2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸途径） | dxr | EcDXR | 催化 | 用于互补实验验证拟南芥DXR的功能，突变体dxr::TET被AtDXR-L和AtDXR-S拯救 |
关键发现
- 拟南芥DXR由单拷贝基因编码，位于5号染色体，含12个外显子和11个内含子，覆盖3.2 kb区域
- 全长cDNA编码477个氨基酸，预测分子量52 kD，转录本约1.8 kb。植物DXR的N端有73-80个残基的质体转运肽，成熟蛋白N端含6-8个脯氨酸的保守区域，共识序列为P(P/Q)PAWPG(R/T)A。DXR-GFP融合蛋白定位于叶绿体，免疫电镜证实金颗粒仅在叶绿体中。在大肠杆菌dxr突变体互补实验中，表达AtDXR-L（残基57-477）的菌落大小为2-3 mm，而AtDXR-S（残基81-477）菌落仅0.3-0.4 mm。DXR转录本在幼苗和花序中高水平积累，光诱导转录显著增加（暗转光6 h和24 h后明显升高）。100 μM fosmidomycin处理7天幼苗后1 h，DXR蛋白急剧积累，而DXS蛋白水平不变。DXR-GUS表达模式与DXS-GUS平行，但在茎和根中更受限。
研究结论
拟南芥DXR基因参与MEP途径的调控，其表达受发育和环境（光）调节，蛋白定位于质体，可能作为MEP途径的调控节点之一。