Overexpression of AtCPS and AtKS in Arabidopsis Confers Increased ent-Kaurene Production But No Increase in Bioactive Gibberellins
- 作者
- Christine M. Fleet, Shinjiro Yamaguchi, Atsushi Hanada, Hiroshi Kawaide, Charles J. David, Yuji Kamiya, Tai-ping Sun
- 单位
- Department of Biology, Box 91000, Duke University, Durham, North Carolina 27708; Plant Science Center, RIKEN, 2-1 Hirosawa, Wako-shi, Saitama 351-0198, Japan
- 杂志
- Plant Physiology（2003）
- DOI
- 10.1104/pp.103.021725
- 所属领域
- 植物代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
探究赤霉素（GA）生物合成途径早期步骤中CPS和KS过表达对代谢流及活性GA水平的影响，并鉴定途径中的限速步骤。
研究策略
构建AtCPS和AtKS单基因及双基因过表达转基因拟南芥株系，通过气相色谱-选择离子监测（GC-SIM）检测ent-kaurene、kaurenoic acid及多种GA中间产物含量，结合形态学分析和PAC抑制剂实验，评估代谢通量变化。
研究路线图
核心内容
为探究赤霉素（GA）生物合成途径中的限速步骤，该研究在拟南芥中分别及同时过表达早期关键酶基因AtCPS和AtKS，利用GC-SIM定量检测各代谢中间体含量并结合形态学与PAC抑制剂实验评估代谢通量变化。结果显示，单过表达CPS使ent-kaurene水平提高约1008倍，CPS/KS共过表达则提高约1888倍，而单独过表达KS无此效果，证实CPS是ent-kaurene合成的限速酶。尽管早期中间体大幅积累，如kaurenoic acid增加逾千倍、GA12升至野生型的12.7倍，但活性GA4和GA1及其下游代谢物水平均与野生型无显著差异，形态上亦未出现GA过量表型，且相关下游酶基因mRNA水平未下降。结果表明KAO催化的步骤可能构成GA合成的另一限速环节，同时植物通过多重稳态调节机制维持活性GA水平恒定，提示仅强化途径上游难以有效提升活性GA产量。
创新点
首次同时过表达AtCPS和AtKS，发现CPS是ent-kaurene合成的限速酶；通过代谢物积累差异揭示ent-kaurenoic acid氧化酶（KAO）可能是GA合成的另一个限速环节；证实植物能维持活性GA稳态而不受早期中间体大幅积累影响。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 拟南芥 | 赤霉素生物合成 | AtCPS (GA1) | ent-柯巴基焦磷酸合酶 | 催化 | 催化GGDP转化为ent-CDP，是GA生物合成的第一个限速步骤 |
| 拟南芥 | 赤霉素生物合成 | AtKS (GA2) | ent-贝壳杉烯合酶 | 催化 | 催化ent-CDP转化为ent-kaurene，与CPS协同作用 |
| 拟南芥 | 赤霉素生物合成 | AtKO | ent-贝壳杉烯氧化酶 | 催化 | 催化ent-kaurene氧化为ent-kaurenoic acid，PAC抑制该酶 |
| 拟南芥 | 赤霉素生物合成 | AtKAO1 | ent-kaurenoic acid氧化酶 | 催化 | 催化ent-kaurenoic acid转化为GA12，可能为限速步骤 |
| 拟南芥 | 赤霉素生物合成 | AtKAO2 | ent-kaurenoic acid氧化酶 | 催化 | 与AtKAO1同工，催化ent-kaurenoic acid转化为GA12，表达未下调 |
| 拟南芥 | 赤霉素生物合成 | AtGA20ox1 | GA20-氧化酶 | 催化 | 催化GA12/GA53到GA9/GA20的多步反应，受负反馈调控 |
| 拟南芥 | 赤霉素生物合成 | AtGA3ox1 | GA3-氧化酶 | 催化 | 催化GA9/GA20转化为活性GA4/GA1，在过表达株系中表达未下降 |
| 拟南芥 | 赤霉素生物合成 | AtGA2ox7/8 | GA2-氧化酶 | 催化 | 催化C20-GA的2β-羟基化失活，可能参与GA稳态调节 |
关键发现
- CPS OE-a使ent-kaurene水平增加约1008倍，CPS/KS OE-a增加约1888倍
- KA水平分别增加约1112倍和963倍（CPS OE-a和CPS/KS OE-a）
- GA12在CPS OE-a中为WT的12.7倍，在CPS OE-b中为5.9倍，在CPS/KS OE-a中为10.8倍
- GA15、GA24和GA53也有数倍升高，但活性GA4、GA1及下游代谢物GA9、GA20、GA34、GA51、GA8、GA29均与WT相似。KS单过表达不增加ent-kaurene水平（与WT相近）。CPS/KS OE-a和CPS OE-a在0.5 μM PAC下仍保持较长下胚轴，且1 μM PAC处理下开花时间仅延迟约1天，而WT和KS OE明显受抑制。AtKAO1、AtKAO2、AtGA20ox1和AtGA3ox1的mRNA水平在过表达株系中未显著下降。
研究结论
研究表明CPS是ent-kaurene产生的限速酶，而KAO催化步骤可能限制后期GA中间体的合成；植物通过多重稳态调节机制维持活性GA水平，即使早期代谢中间体大幅积累也不导致GA过量表型。