高级醇 · 代谢工程文献库

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Simultaneous Suppression of Multiple Genes by Single Transgenes. Down-Regulation of Three Unrelated Lignin Biosynthetic Genes in Tobacco

作者
James C. Abbott, Abdellah Barakate, Gaelle Pinçon, Michel Legrand, Catherine Lapierre, Isabelle Mila, Wolfgang Schuch, Claire Halpin
单位
Division of Environmental and Applied Biology, School of Life Sciences, University of Dundee; Institut de Biologie Moléculaire des Plantes du Centre National de la Recherche Scientifique, Université Louis Pasteur; Laboratoire de Chimie Biologique, Institut National Agronomique; Wheat Improvement Centre, Syngenta
杂志
Plant Physiology（2002）
DOI
10.1104/pp.010698
所属领域
代谢工程
关键词
CADCCRCOMT基因沉默嵌合转基因木质素生物合成烟草
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解决的核心问题

如何利用单一转基因同时高效抑制多个木质素生物合成基因，以快速获得多重基因协调下调的植物，并解决传统杂交方法中转基因组合不稳定、效果不可预测的问题

研究策略

构建分别包含两个或三个木质素基因（CAD、COMT、CCR）部分正义序列的单一嵌合转基因，在烟草中表达以同时抑制多个靶基因，并与通过杂交组合不同反义转基因的传统方法进行比较

研究路线图

单一转基因同时抑制多个木质素基因
策略：构建含CAD/COMT/CCR部分正义序列的单一嵌合转基因，与传统杂交方法比较
关键改造：嵌合部分正义构建体（双基因CO、三基因COC）转化烟草
结果1 酶活协同下调：CO5株系CAD降至15%、COMT降至36%；COC6株系CAD降至4%、COMT降至24%、CCR降至18%
结果2 木质素含量及结构改变：CO5木质素含量降低20-30%；木质部青铜色，Maüle染色减弱示S木质素减少；COC6和COC7生长迟缓、导管畸形
对照结果 传统杂交法不理想：反义转基因杂交子代酶活变异8-100%，多数无预期木质素结构改变
结论：嵌合构建体快速、协调、稳定抑制多基因，优于杂交，可推广至其他代谢通路
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核心内容

该研究提出并验证了利用单一嵌合转基因同时抑制多个木质素生物合成基因的策略。作者在烟草中构建了分别包含两个或三个木质素基因（CAD、COMT、CCR）部分正义序列的嵌合构建体，以同时下调多个靶基因，并与通过杂交组合反义转基因的传统方法进行对比。结果表明，嵌合构建体在转基因植株中实现了稳定且高效的协同抑制：CO5株系中CAD活性降至野生型的15%、COMT降至36%，而COC6株系中CAD降至4%、COMT降至24%、CCR降至18%，CO5木质素含量降低20%–30%，木质部呈现青铜色且Maüle染色显著减弱，表明S木质素减少。相比之下，杂交子代的目标酶活性变幅达8%–100%，多数未出现预期的木质素结构改变。该策略不仅优于杂交方法，且可推广至任意代谢通路的多基因协同调控，为植物代谢工程提供了快速可靠的工具。

创新点

首次证明单一嵌合部分正义构建体可同时抑制三个不相关的木质素生物合成基因；相比杂交方法，嵌合构建体引起的靶基因抑制更稳定、效果更强，且能避免转基因沉默，快速产生多重基因下调的植物

研究对象（3）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
烟草（Nicotiana tabacum cv Samsun NN） 木质素生物合成 COMT (caffeate/5-hydroxyferulate O-methyltransferase) COMT 催化 部分正义序列被包含在嵌合转基因中，靶向抑制COMT表达
烟草（Nicotiana tabacum cv Samsun NN） 木质素生物合成 CCR (cinnamoyl-coenzyme A reductase) CCR 催化 部分正义序列被包含在嵌合转基因中，靶向抑制CCR表达
烟草（Nicotiana tabacum cv Samsun NN） 木质素生物合成 CAD (cinnamyl alcohol dehydrogenase) CAD 催化 部分正义序列被包含在嵌合转基因中，靶向抑制CAD表达

关键发现

  1. 嵌合部分正义构建体成功在烟草中同时抑制了CAD、COMT和CCR三个木质素基因。成熟期CO5株系CAD活性降至野生型的15%，COMT降至36%
  2. COC6株系CAD降至4%，COMT降至24%，CCR降至18%。CO5株系木质素含量降低20%-30%。而通过杂交组合反义转基因的子代中，目标酶活性变异范围为8%-100%，多数子代未出现预期的木质素结构改变（如B10×J40杂交子代硫代酸解产物与野生型相近，碱性溶解度约29%接近野生型的27%）。嵌合转基因植物木质部呈现青铜色（CO5、COC6、COC7），Maüle染色显著减弱，表明S木质素减少
  3. COC6和COC7还表现出生长迟缓和畸形木质部导管表型。

研究结论

嵌合部分正义沉默构建体能快速、协调、稳定地抑制多个木质素合成基因，显著优于传统杂交方法，且可推广应用于任何代谢通路的多基因协同调控，为植物代谢工程提供了有力工具

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