Golden Indica and Japonica Rice Lines Amenable to Deregulation
- 作者
- Tran Thi Cuc Hoa, Salim Al-Babili, Patrick Schaub, Ingo Potrykus, Peter Beyer
- 单位
- Institute for Plant Sciences, Swiss Federal Institute of Technology, CH-8092 Zurich, Switzerland; University of Freiburg, Center for Applied Biosciences, Schänzlestrasse 1, D-79104 Freiburg, Germany
- 杂志
- Plant Physiology（2003）
- DOI
- 10.1104/pp.103.023457
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
金色大米（GoldenRice）从概念验证走向实际应用面临品种适应性（籼稻是维生素A缺乏地区主食）和监管合规（抗生素标记、边界外DNA、多拷贝整合）等问题，需要培育既能在籼稻中表达又符合监管要求的转基因水稻品系。
研究策略
采用农杆菌介导转化，构建pCaCar载体（含psy和crtI基因，PMI正筛选标记），转化籼稻IR64、MTL250及粳稻Taipei 309，通过PCR检测边界外转移，优先选择单拷贝、简单整合的品系，并推进至T3代。
研究路线图
核心内容
针对金色大米从概念走向应用面临的两个瓶颈——籼稻品种适应性（籼稻正是维生素A缺乏地区的主粮）和监管合规性（抗生素标记、边界外DNA、多拷贝整合），该研究将携带psy、crtI两个类胡萝卜素合成基因以及PMI正向选择标记（完全取代抗生素抗性标记）的pCaCar载体，通过农杆菌转化导入籼稻优良品种IR64、MTL250和粳稻Taipei 309，并用PCR筛查边界外转移，将单拷贝且整合简单的品系推进至T3代。T1代种子总类胡萝卜素含量为0.1~0.9微克每克干重，T2代最优粳稻品系达1.2微克每克干重，最优籼稻品系为0.8微克每克干重；具维生素A活性的类胡萝卜素占比在籼稻中达81%~93%，显著高于粳稻的56%~87%。多数品系为1~3个拷贝，γ-谷维醇含量显著升高而维生素E类无显著变化。该工作确证仅需两个外源基因即可在籼稻中重建类胡萝卜素通路并激活内源下游酶，同时培育出三个无抗生素标记、整合清晰的品系，为后续营养评估、生物利用度研究和育种开发奠定基础。
创新点
['首次将金色大米技术应用于籼稻优良品种IR64和MTL250，使其适用于维生素A缺乏地区。', '以磷酸甘露糖异构酶（PMI）作为唯一选择标记，完全取代抗生素抗性标记。', '通过PCR检测T-DNA边界外转移，确保插入片段纯净，利于监管审批。', '验证仅需psy和crtI两个外源基因即可重建整条类胡萝卜素通路，并激活内源番茄红素环化酶和羟化酶等。', '发现转基因籽粒中γ-谷维醇含量显著升高，而维生素E类化合物无显著变化。']
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Oryza sativa subsp. japonica cv. Taipei 309 | 类胡萝卜素生物合成途径 | psy | 八氢番茄红素合酶（PSY） | 催化 | 来自水仙（Narcissus pseudonarcissus），由胚乳特异性谷蛋白Gt1启动子驱动。 |
| Oryza sativa subsp. japonica cv. Taipei 309 | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtI | 细菌八氢番茄红素脱氢酶（CrtI） | 催化 | 与豌豆RuBisCo小亚基转运肽（SSU-tp）融合，由CaMV 35S启动子驱动。 |
| Oryza sativa subsp. indica cv. IR64 | 类胡萝卜素生物合成途径 | psy | 八氢番茄红素合酶（PSY） | 催化 | 来自水仙，由Gt1启动子驱动。 |
| Oryza sativa subsp. indica cv. IR64 | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtI | 细菌八氢番茄红素脱氢酶（CrtI） | 催化 | 与SSU-tp融合，由CaMV 35S启动子驱动。 |
| Oryza sativa subsp. indica cv. MTL250 | 类胡萝卜素生物合成途径 | psy | 八氢番茄红素合酶（PSY） | 催化 | 来自水仙，由Gt1启动子驱动。 |
| Oryza sativa subsp. indica cv. MTL250 | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtI | 细菌八氢番茄红素脱氢酶（CrtI） | 催化 | 与SSU-tp融合，由CaMV 35S启动子驱动。 |
| 水稻转化体系 | 甘露糖代谢途径 | pmi | 磷酸甘露糖异构酶（PMI） | 催化 | 作为正选择标记，来自p-Man19，由CaMV 35S启动子驱动，替代抗生素标记。 |
| 水稻转化体系 | 蛋白质亚细胞定位 | SSU-tp | 豌豆RuBisCo小亚基转运肽 | 区室化 | 与CrtI融合，引导其进入质体。 |
关键发现
- T1代种子总类胡萝卜素含量为0.1~0.9 μg/g干重
- T2代最优粳稻品系48-67CR58为1.2 μg/g干重，籼稻品系37B-2b和37B-5分别为0.4和0.8 μg/g干重。β-胡萝卜素占总类胡萝卜素比例：粳稻39%~67%，籼稻61%~82%
- 具维生素A活性的类胡萝卜素（β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、β-隐黄质）占比：粳稻56%~87%，籼稻81%~93%。获得独立转基因植株数：IR64 23个、MTL250 7个、Taipei 309 27个，多数为1~3个拷贝。γ-谷维醇在多数转基因品系中显著增加，维生素E（生育酚/生育三烯酚）无明显变化。
研究结论
成功培育出三个符合监管要求的金色大米品系（Taipei 309 48-67CR58、IR64 37B-2b和37B-5），这些T3代品系具有清晰整合模式且不含抗生素标记，为后续营养评估、生物利用度研究和育种开发奠定了基础。