Increased and Altered Fragrance of Tobacco Plants after Metabolic Engineering Using Three Monoterpene Synthases from Lemon
- 作者
- Joost Lücker, Wilfried Schwab, Bianca van Hautum, Jan Blaas, Linus H. W. van der Plas, Harro J. Bouwmeester, Harrie A. Verhoeven
- 单位
- Business Unit Bioscience, Plant Research International, P.O. Box 16, 6700 AA, Wageningen, The Netherlands; University of Würzburg, Chair of Food Chemistry, Am Hubland, 97974, Würzburg, Germany; Laboratory of Plant Physiology, Wageningen University, Arboretumlaan 4, 6703 BD, Wageningen, The Netherlands
- 杂志
- Plant Physiology（2004）
- DOI
- 10.1104/pp.103.030189
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
提高并改变烟草花和叶的单萜挥发物释放，以改善香气并研究植物-昆虫互作，同时探索同时引入多个竞争同一底物的外源萜烯合酶的可行性。
研究策略
通过农杆菌介导的遗传转化，分别将来自柠檬的三种单萜合酶基因（γ-萜品烯合酶、柠檬烯合酶、β-蒎烯合酶）导入烟草品种Petit Havana SR1，获得单插入转基因系，再通过杂交将三者组合到同一植株中，利用SPME和Tenax捕集结合GC-MS分析挥发物释放谱。
研究路线图
核心内容
研究通过农杆菌介导的遗传转化，将来自柠檬的γ-萜品烯合酶、柠檬烯合酶和β-蒎烯合酶基因分别导入烟草品种Petit Havana SR1，获得单插入转基因系后再经杂交将三者组合到同一植株中，利用SPME和Tenax捕集结合GC-MS分析挥发物释放谱。结果显示，转基因烟草叶片和花朵释放β-蒎烯、柠檬烯、γ-萜品烯及多种副产物，总单萜释放量较野生型增加10至25倍，年轻叶片中三种主要单萜释放量最高达750 ng g⁻¹ FW 24h⁻¹，花朵中柠檬烯释放量达1206 ng g⁻¹ 24h⁻¹；野生型花主要释放芳樟醇和β-石竹烯，转基因花中β-石竹烯降低2至3倍。同时，(+)-柠檬烯对映体过量近100%，而含三个合酶的转基因花中其e.e.为92%，(-)-β-蒎烯e.e.达86%至92%。结果表明烟草中存在足够的GPP底物或可诱导其合成，该策略可大幅提高单萜产量并改变香气成分，为改良花卉香气及研究植物-昆虫互作提供了可行途径。
创新点
首次报道在植物中同时表达多个外源单萜合酶并使其竞争同一底物GPP；通过杂交将三个单萜合酶基因组合到同一植株；显著增加了单萜产量并大幅改变烟草叶片和花朵的香气组成。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 烟草（Nicotiana tabacum cv Petit Havana SR1） | 单萜生物合成（MEP途径，质体） | γ-terpinene synthase (TER) | γ-萜品烯合酶 | 催化 | 来自柠檬（Citrus limon），GenBank登录号AF514286，主要产物为γ-萜品烯，副产物含α-萜品烯、柠檬烯等 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv Petit Havana SR1） | 单萜生物合成（MEP途径，质体） | (+)-limonene synthase (LIM) | (+)-柠檬烯合酶 | 催化 | 来自柠檬，GenBank登录号AF514287，主要产物为(+)-柠檬烯，几乎不含副产物 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv Petit Havana SR1） | 单萜生物合成（MEP途径，质体） | (-)-β-pinene synthase (PIN) | (-)-β-蒎烯合酶 | 催化 | 来自柠檬，GenBank登录号AF514288，主要产物为(-)-β-蒎烯，副产物含桧烯和γ-萜品烯 |
关键发现
- 转基因烟草叶片和花朵释放β-蒎烯、柠檬烯和γ-萜品烯及多种副产物（如α-侧柏烯、α-蒎烯、桧烯、月桂烯、p-伞花烃等），总单萜释放量较野生型增加10-25倍
- 年轻叶片中三种主要单萜释放量达150-350 ng g^-1 24h^-1，总量最高达750 ng g^-1 FW 24h^-1
- 花朵中释放量范围为400-2400 ng g^-1 FW 24h^-1，其中阶段8花朵柠檬烯释放量达1206 ng g^-1 24h^-1、γ-萜品烯630 ng g^-1 24h^-1、β-蒎烯356 ng g^-1 24h^-1
- 野生型花主要释放芳樟醇（127-207 ng g^-1 24h^-1）和β-石竹烯（182-468 ng g^-1 24h^-1），转基因花β-石竹烯降低2-3倍
- LIM-21植物中(+)-柠檬烯对映体过量近100%，含三个合酶的转基因花中(+)-柠檬烯e.e.为92%（阶段8）和51%（阶段10），(-)-β-蒎烯e.e.为86%和92%
- 内源芳樟醇e.e.为52% R-型
- 花中柠檬烯和γ-萜品烯释放量相关系数r^2=0.98，β-蒎烯与γ-萜品烯r^2=0.24
- 幼叶单萜释放量约为老叶的5-10倍。
研究结论
通过同时表达三种柠檬单萜合酶可大幅提高烟草单萜产量并改变香气成分，表明烟草叶片和花朵中存在足够的GPP底物或可诱导其合成，该策略可用于改良花卉香气、研究植物-昆虫互作及化学生态学。