Wound-Inducible Biosynthesis of Phytoalexin Hydroxycinnamic Acid Amides of Tyramine in Tryptophan and Tyrosine Decarboxylase Transgenic Tobacco Lines
- 作者
- Gabriel Guillet, Vincenzo De Luca
- 单位
- Department of Biological Sciences, University of Montreal, Montreal, Quebec, Canada H3C 3J7
- 杂志
- Plant Physiology（2005）
- DOI
- 10.1104/pp.104.050294
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
验证酪氨酸脱羧酶（TYDC）是否对创伤诱导的羟基肉桂酸酪胺酰胺（PCAAT）生物合成具有限速作用，并探究色胺能否被烟草酪胺羟基肉桂酰转移酶（THT）接受为底物。
研究策略
构建表达色氨酸脱羧酶（TDC）、酪氨酸脱羧酶（TYDC）或两者兼有的转基因烟草品系，比较不同基因型在创伤后PCAAT的积累水平、放射性标记酪氨酸/色氨酸的代谢分布和相关酶活性变化。
核心内容
本研究在烟草中分别或共同表达色氨酸脱羧酶（TDC）与酪氨酸脱羧酶（TYDC），验证TYDC对创伤诱导的羟基肉桂酸酪胺酰胺（PCAAT）生物合成是否限速，并考察色胺能否被烟草酪胺羟基肉桂酰转移酶（THT）利用。结果显示，TYDC表达系创伤后甲醇可溶性PCAAT水平比对照高约250%；放射性标记实验表明，伤口0–2毫米和2–4毫米区域可溶性PCAAT积累最高达对照的15.9倍，壁结合形式达4.5倍，而远离伤口区域游离及壁结合酪胺含量高近10倍。TYDC转基因活性比野生型高15–26倍，创伤还使4CL和THT活性增加近10倍、过氧化物酶活性增加20倍。一个月龄TYDC系叶片酪胺含量约800微克/克干重，对照仅10微克/克；创伤后8小时TYDC系酪胺转化率约1.5%，对照仅约0.1%。研究表明，TYDC在特定条件下对PCAAT碳流分配具有限速控制作用，色胺不是烟草THT的合适底物；增强TYDC可促进伤口部位PCAAT局部积累和细胞壁整合，但高效转化仍需与4CL、THT协同优化。
创新点
利用转基因策略提高TYDC活性，证实其在特定条件下是PCAAT生物合成的限速步骤；同时通过TDC转基因品系证明色胺不是烟草THT的合适底物，并揭示了PCAAT在伤口部位的局部积累和细胞壁整合增强。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 烟草（Nicotiana tabacum cv Xanthi） | 色氨酸脱羧途径 | TDC | 色氨酸脱羧酶（EC 4.1.1.28） | 催化 | 催化色氨酸脱羧生成色胺，在转基因烟草中高表达导致色胺积累。 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv Xanthi） | 酪氨酸脱羧途径 / PCAAT生物合成 | TYDC | 酪氨酸脱羧酶（EC 4.1.1.25） | 催化 | 催化酪氨酸脱羧生成酪胺，是PCAAT合成的限速步骤之一。 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv Xanthi） | 苯丙烷代谢 | 4CL | 4-香豆酸辅酶A连接酶（EC 6.2.1.12） | 催化 | 催化香豆酸等生成相应的辅酶A硫酯，为酰胺化提供底物。 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv Xanthi） | 羟基肉桂酸酪胺酰胺（PCAAT）生物合成 | THT | 酪胺羟基肉桂酰转移酶（EC 2.3.1.110） | 催化 | 催化酪胺与肉桂酰辅酶A形成p-香豆酰酪胺和阿魏酰酪胺。 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv Xanthi） | 酚酰胺细胞壁结合 | peroxidase | 过氧化物酶（EC 1.11.1.7） | 催化 | 介导PCAAT氧化偶联整合到细胞壁，增强细胞壁防御。 |
关键发现
- TYDC表达系（TYDC和TDC×TYDC）创伤后MeOH可溶性PCAAT水平比未转化对照或TDC系高约250%。放射性标记实验显示，TYDC表达系在伤口0-2mm和2-4mm同心区可溶性PCAAT积累高达对照的15.9倍，壁结合PCAAT高达4.5倍
- 在远离伤口4-8mm区域，TYDC系游离和壁结合酪胺含量比对照高近10倍。伤口附近TYDC系酪胺转化为PCAAT的转化率比野生型高2-3倍。机械创伤诱导4CL和THT活性增加近10倍，过氧化物酶活性增加20倍
- TYDC转基因系TYDC活性比野生型高15-26倍，且野生型和TDC系创伤后TYDC活性仍被诱导8-15倍。1个月大的TYDC表达系叶片酪胺含量约800 μg/g干重，而对照仅10 μg/g干重
- 创伤后8小时，TYDC系和对照系酪胺转化为PCAAT的转化率分别约为0.1%和1.5%。
研究结论
研究表明，在某些条件下TYDC活性对酪胺基羟基肉桂酸酰胺（PCAAT）生物合成的碳流分配具有限速控制作用；色胺不能作为烟草THT的底物。增加TYDC表达能增强伤口部位PCAAT的局部积累和细胞壁整合，但最大化转化为需与4CL和THT等协同优化。