The Biochemical and Molecular Basis for the Divergent Patterns in the Biosynthesis of Terpenes and Phenylpropenes in the Peltate Glands of Three Cultivars of Basil
- 作者
- Yoko Iijima, Rachel Davidovich-Rikanati, Eyal Fridman, David R. Gang, Einat Bar, Efraim Lewinsohn, Eran Pichersky
- 单位
- Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan; Department of Plant Sciences and Institute for Biomedical Science and Biotechnology, University of Arizona; Department of Vegetable Crops, Newe Ya'ar Research Center, Agricultural Research Organization
- 杂志
- Plant Physiology（2004）
- DOI
- 10.1104/pp.104.051318
- 所属领域
- 植物次生代谢
- 关键词
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解决的核心问题
解析甜罗勒三个品种（EMX、SD、SW）腺毛中萜烯和苯丙烯类化合物生物合成模式差异的生化与分子机制
研究策略
对三个品种腺毛进行挥发物定量、萜烯合酶（TPS）活性、异戊烯转移酶活性、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性测定，结合EST数据库克隆鉴定多个TPS基因，通过基因表达分析、序列比较和嵌合酶构建研究产物特异性的分子基础
核心内容
本研究以甜罗勒三个品种（EMX、SD、SW）的盾状腺毛为对象，系统解析了萜烯与苯丙烯类挥发物合成模式差异的生化及分子基础。通过挥发物定量、酶活测定及EST库克隆，鉴定出9个萜烯合酶基因，并发现SD品种中一个因单碱基插入导致移码突变的(R)-芳樟醇合酶假基因。关键结果显示，SD品种总萜含量最高（12.6 mg/g FW），其中单萜10.5 mg/g FW，其单萜合酶活性较SW高约5倍、较EMX高约15倍；EMX则以苯丙烯类为主（甲基胡椒酚4.5 mg/g FW），其PAL活性（27.2 pkat/mg蛋白）显著高于SD（9.8 pkat/mg蛋白）。萜烯总量与TPS总活性正相关，与PAL活性及苯丙烯含量负相关。嵌合酶实验表明，GES/LIS杂合酶（N端来自GES）可同时催化生成香叶醇与(R)-芳樟醇（比例8:2），而反向嵌合无活性，揭示了产物特异性的结构基础。研究证明TPS基因差异表达是品种间萜烯化学型的主要决定因素，同时MEP与MVA途径的代谢串扰影响最终产物分配。
创新点
首次从罗勒中鉴定出9个萜烯合酶基因；发现SD品种中一个因单碱基插入导致移码突变的(R)-芳樟醇合酶基因；构建GES/LIS杂合酶实现单酶同时催化生成香叶醇和(R)-芳樟醇；揭示TPS基因差异表达是品种间萜烯化学型形成的主要原因
研究对象（15）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 罗勒（Ocimum basilicum）腺毛 | 单萜生物合成 | LIS | (R)-芳樟醇合酶 | 催化 | SW品种中高表达，催化GPP生成(R)-芳樟醇；SD品种中存在因第228-229位密码子间插入一个T导致移码突变的LIS基因，编码截短的非功能蛋白 |
| 罗勒（Ocimum basilicum）腺毛 | 单萜生物合成 | GES | 香叶醇合酶 | 催化 | SD品种特异，催化GPP生成香叶醇；与LIS蛋白序列一致性81% |
| 罗勒（Ocimum basilicum）腺毛 | 单萜生物合成 | TES | 萜品油烯合酶 | 催化 | 仅SW品种，主要产物萜品油烯，也生成柠檬烯、β-蒎烯及一种未鉴定单萜 |
| 罗勒（Ocimum basilicum）腺毛 | 单萜生物合成 | FES | 葑醇合酶 | 催化 | 三个品种均存在，主要产物葑醇，也生成α-蒎烯、柠檬烯等 |
| 罗勒（Ocimum basilicum）腺毛 | 单萜生物合成 | MYS | β-月桂烯合酶 | 催化 | 三个品种均存在，与FES核苷酸序列一致性95.1%，专一生成β-月桂烯 |
| 罗勒（Ocimum basilicum）腺毛 | 倍半萜生物合成 | CDS | γ-杜松烯合酶 | 催化 | 仅SW品种EST数据库中发现，催化FPP生成γ-杜松烯及其他倍半萜 |
| 罗勒（Ocimum basilicum）腺毛 | 倍半萜生物合成 | SES | 蛇床烯合酶 | 催化 | 三个品种均存在，主要产物β-蛇床烯和α-蛇床烯，也生成其他倍半萜 |
| 罗勒（Ocimum basilicum）腺毛 | 倍半萜生物合成 | ZIS | α-姜黄烯合酶 | 催化 | 三个品种均存在，主要产物α-姜黄烯；也可利用GPP生成β-蒎烯、柠檬烯和α-松油醇，但活性仅为FPP的1/13 |
| 罗勒（Ocimum basilicum）腺毛 | 倍半萜生物合成 | GDS | 大牻牛儿烯D合酶 | 催化 | 三个品种均存在，主要产物大牻牛儿烯D，也生成其他倍半萜 |
| 罗勒（Ocimum basilicum）腺毛 | 萜烯前体合成 | GPPS (小亚基/大亚基) | 香叶基二磷酸合酶 | 催化 | 催化IPP和DMAPP缩合生成GPP，为单萜合酶提供底物；小亚基转录水平在三个品种中均高于大亚基 |
| 罗勒（Ocimum basilicum）腺毛 | 萜烯前体合成 | FPPS | 法尼基二磷酸合酶 | 催化 | 催化两分子IPP和一分子DMAPP缩合生成FPP，为倍半萜合酶提供底物 |
| 罗勒（Ocimum basilicum）腺毛 | 苯丙烷/苯丙烯类生物合成 | PAL | 苯丙氨酸解氨酶 | 催化 | 苯丙烷途径第一个关键酶，活性与苯丙烯含量正相关，与萜烯含量负相关；EMX活性最高（27.2 pkat/mg蛋白） |
| 罗勒（Ocimum basilicum）腺毛 | 苯丙烷/苯丙烯类生物合成 | C4H | 肉桂酸-4-羟化酶 | 催化 | 三个品种转录水平相近 |
| 罗勒（Ocimum basilicum）腺毛 | 苯丙烷/苯丙烯类生物合成 | 4CL | 4-香豆酸辅酶A连接酶 | 催化 | EMX品种转录水平最高，SD最低 |
| 大肠杆菌（E. coli）表达系统 | 单萜生物合成 | GES/LIS 嵌合基因 | GES/LIS杂合酶 | 催化 | 由GES N端1-360密码子和LIS C端361-574密码子融合而成，催化GPP同时生成香叶醇和(R)-芳樟醇（8:2）；反向嵌合LIS/GES无活性 |
关键发现
- EMX品种主要挥发性成分为甲基胡椒酚（4.5 mg/g FW），萜烯总量最低（总萜1.7 mg/g FW）
- SD品种富含香叶醛（6.5 mg/g FW）和橙花醛（3.1 mg/g FW），总萜最高（12.6 mg/g FW），其中单萜10.5 mg/g FW、倍半萜2.1 mg/g FW
- SW品种以(R)-芳樟醇为主（2.1 mg/g FW），总萜4.4 mg/g FW。SD单萜合酶活性比SW高约5倍、比EMX高约15倍
- SD倍半萜合酶活性比EMX高1.7倍。PAL活性EMX为27.2 pkat/mg蛋白，SD为9.8 pkat/mg蛋白，SW为17.4 pkat/mg蛋白。萜烯总量与TPS总活性正相关，与苯丙烯含量及PAL活性负相关。GES/LIS杂合酶（N端360个密码子来自GES，C端361-574来自LIS）可同时生成香叶醇和(R)-芳樟醇，比例为8:2
- 反向嵌合酶LIS/GES无活性。ZIS利用GPP的活性仅为利用FPP的1/13。
研究结论
罗勒三个品种腺毛中萜烯组成差异主要由TPS基因的差异表达决定，同时存在因移码突变导致的假基因化；总萜烯产量与TPS总活性正相关，与PAL活性及苯丙烯含量负相关，而GPPS/FPPS活性主要影响单萜与倍半萜的比例而非总量；MEP和MVA途径之间存在代谢串扰可能影响最终产物分配。