Identification of Syn-Pimara-7,15-Diene Synthase Reveals Functional Clustering of Terpene Synthases Involved in Rice Phytoleaxin/Allelochemical Biosynthesis
- 作者
- P. Ross Wilderman, Meimei Xu, Yinghua Jin, Robert M. Coates, Reuben J. Peters
- 单位
- Department of Biochemistry, Biophysics, and Molecular Biology, Iowa State University, Ames, Iowa 50011; Department of Chemistry, University of Illinois, Urbana, Illinois 61801
- 杂志
- Plant Physiology（2004）
- DOI
- 10.1104/pp.104.045971
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定水稻中参与植保素/化感物质 momilactone 生物合成的关键酶 syn-CPP 特异性 9β-pimara-7,15-diene 合酶（OsDTS2），并揭示其与上游 syn-CPP 合酶基因的物理连锁和功能聚类关系。
研究策略
基于功能基因组学方法，从水稻4号染色体已测序基因中筛选候选 I 类萜烯合酶基因，从 UV 诱导的水稻叶片中克隆 cDNA，在大肠杆菌中异源表达并纯化重组蛋白，以 GGPP、ent-CPP 和 syn-CPP 为底物进行酶活检测，结合 GC-MS 鉴定产物，并通过半定量 RT-PCR 分析表达模式及遗传定位比较。
核心内容
该研究通过功能基因组学手段，从水稻4号染色体上筛选并克隆了候选I类萜烯合酶基因OsDTS2，在大肠杆菌中异源表达重组蛋白后，以GGPP、ent-CPP和syn-CPP为底物进行酶活检测。结果显示OsDTS2编码含840个氨基酸的蛋白质，仅以syn-CPP为底物催化生成syn-pimara-7,15-diene，对GGPP和ent-CPP无活性，是首个被鉴定的syn-CPP特异性I类萜烯合酶。UV辐射和0.5 mM MeJA处理可显著诱导水稻叶片中OsDTS2 mRNA上调，而根部为组成型低水平表达。遗传定位发现OsDTS2与上游syn-CPP合酶OsCPSsyn基因紧密连锁于4号染色体14.3 cM处，相距不到120 kb，而ent-途径的相关基因则分布于2号染色体86 cM处的150 kb区域内。该发现揭示了功能相关的萜烯合酶基因通过物理聚类和共调控参与momilactone生物合成的进化机制，OsDTS2催化的环化步骤是植保素合成途径中的关键限速节点，为水稻二萜类次生代谢途径的工程化改造提供了重要靶点。
创新点
['首次鉴定出对 syn-CPP 具有特异性的 I 类萜烯合酶，即 syn-pimara-7,15-diene 合酶（OsDTS2）', '发现 OsDTS2 与 OsCPSsyn 基因在染色体上紧密连锁（14.3 cM，相距约120 kb），共同催化 momilactone 生物合成的连续环化步骤，提供了萜烯合酶基因功能聚类与物理邻近相关的直接证据']
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli C41 | momilactone 生物合成 | OsDTS2 | syn-pimara-7,15-diene synthase | 催化 | 将 syn-CPP 环化为 syn-pimara-7,15-diene，为 momilactone 合成的关键步骤 |
| Escherichia coli C41 | momilactone 生物合成 | OsCPSsyn | syn-copalyl diphosphate synthase | 催化 | 催化 GGPP 生成 syn-CPP，与 OsDTS2 连续作用，基因位于同一染色体区域 |
| Oryza sativa | phytocassane 生物合成 | OsDTC1 | ent-cassa-12,15-diene synthase | 催化 | 与 OsDTS2 同源性约51%，特异性利用 ent-CPP，作为底物选择性比较模型 |
关键发现
['OsDTS2 编码含840个氨基酸的蛋白质，包含 labdane 相关二萜合酶的插入性序列元件和 I 类催化所需的 DDXXD 基序', 'OsDTS2 与已鉴定的 ent-CPP 特异性 cassa-12,15-diene 合酶 OsDTC1 的氨基酸序列一致性约为51%', '重组 GST-OsDTS2 仅以 syn-CPP 为底物，催化生成 syn-pimara-7,15-diene（保留时间12.74 min），对 GGPP 和 ent-CPP 无活性', 'UV 辐射和0.5 mM MeJA 处理显著诱导水稻叶片中 OsDTS2 mRNA 上调，根部则组成型低水平表达', 'OsDTS2 与 syn-CPP 合酶 OsCPSsyn 均定位在水稻4号染色体14.3 cM处，两者相距不到120 kb', '另一个 ent- 途径的 OsCPS2ent 与 OsDTC1 定位在2号染色体86 cM处，四个基因分布在150 kb区域内，提示存在另一个功能聚类']
研究结论
OsDTS2 是首个发现的 syn-CPP 特异性 I 类萜烯合酶，催化 momilactone 生物合成的关键限速步骤，其转录调控是控制植保素/化感物质合成的关键节点。OsDTS2 与 OsCPSsyn 的物理连锁和共分离表明，功能相关的萜烯合酶基因可能通过串联重复和共调控进化形成代谢功能聚类，这为理解水稻二萜类次生代谢途径的进化提供了新视角。