高级醇 · 代谢工程文献库

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Monoterpene Metabolism. Cloning, Expression, and Characterization of (-)-Isopiperitenol(-)-Carveol Dehydrogenase of Peppermint and Spearmint

作者
Kerry L. Ringer, Edward M. Davis, Rodney Croteau
单位
Institute of Biological Chemistry, Washington State University, Pullman, Washington 99164-6340
杂志
Plant Physiology（2005）
DOI
10.1104/pp.104.053298
所属领域
植物代谢与酶学
关键词
(-)-carveol dehydrogenase(-)-isopiperitenol dehydrogenaseMentha spicataMentha x piperitamonoterpene metabolismshort-chain dehydrogenase/reductase
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解决的核心问题

克隆并表征薄荷和留兰香中负责单萜醇氧化的(-)-异胡椒烯醇/(-)-香芹醇脱氢酶，并探讨单萜生物合成中氧化还原酶基因的进化起源

研究策略

利用薄荷油腺分泌细胞cDNA文库随机测序与功能筛选，结合大肠杆菌异源表达和原位活性检测分离脱氢酶cDNA；通过同源PCR克隆留兰香同源物，并进行酶学表征与序列分析

研究路线图

100%
研究问题：克隆表征薄荷/留兰香单萜醇脱氢酶
策略：cDNA文库筛选+异源表达+酶学表征
克隆薄荷ISPD cDNA(795 bp, 265 aa)
同源PCR克隆留兰香香芹醇脱氢酶(>99%同一性)
酶学表征: NAD+依赖, Km=1.8 μM, 二聚体/四聚体
结果：归属SDR超家族，与单萜还原酶祖先不同
结论：脱氢酶与还原酶基因来自不同进化祖先
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核心内容

本研究从薄荷油腺分泌细胞cDNA文库中随机测序并结合功能筛选，首次克隆并功能鉴定了(-)-异胡椒烯醇脱氢酶（ISPD），并通过同源PCR从留兰香中获得其同源香芹醇脱氢酶。薄荷ISPD开放阅读框长795 bp，编码265个氨基酸，留兰香同源酶与其氨基酸一致性超过99%。重组酶以NAD+为辅因子，在pH 7.5时对(-)-trans-carveol的Km为1.8±0.2 μM，kcat为0.02 s-1，pH升至10时kcat提高3倍；对(-)-trans-isopiperitenol的Km为72±10 μM，催化效率约为前者的十分之一。酶对cis-carveol、薄荷醇等底物无活性，且以二聚体和四聚体形式存在。序列分析显示该酶属于短链脱氢酶/还原酶（SDR）超家族，与多种植物SDR有40%以上序列一致性，但与薄荷单萜还原酶仅有约13%同一性。结果表明，薄荷和留兰香的单萜氧化与还原酶基因源自不同的进化祖先，而非简单基因复制分化，为单萜生物合成氧化还原酶的进化起源提供了新见解。

创新点

首次克隆并功能鉴定单萜醇脱氢酶(-)-异胡椒烯醇/(-)-香芹醇脱氢酶；发现该酶属于短链脱氢酶/还原酶（SDR）超家族；揭示薄荷单萜生物合成的脱氢酶与还原酶具有不同的进化祖先

研究对象（2）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli BL21(DE3) 单萜生物合成（薄荷醇/香芹酮生物合成） ISPD ((-)-trans-isopiperitenol dehydrogenase) (-)-异胡椒烯醇脱氢酶（ISPD） 催化 催化(-)-trans-isopiperitenol氧化为(-)-isopiperitenone，同时能利用(-)-trans-carveol
Escherichia coli BL21(DE3) 单萜生物合成（香芹酮生物合成） carveol dehydrogenase (spearmint homolog) (-)-香芹醇脱氢酶 催化 留兰香同源酶，与薄荷ISPD氨基酸一致性>99%，催化(-)-trans-carveol氧化为(-)-carvone

关键发现

  1. 薄荷(-)-ISPD cDNA开放阅读框795 bp，编码265个氨基酸残基，计算分子量27,191 Da
  2. 留兰香同源酶与薄荷酶氨基酸一致性>99%。重组酶以NAD+为辅因子，在pH 7.5时对(-)-trans-carveol的Km为1.8±0.2 μM，对NAD+的Km为410±29 μM，kcat为0.02 s-1
  3. pH 10时kcat提高3倍。对(-)-trans-isopiperitenol的Km为72±10 μM，kcat约为carveol的1/10。NADP+相对活性约8%。其他底物相对活性：isopiperitenol 10%、neomenthol 8%、neoisomenthol 4%
  4. cis-carveol、menthol等不能氧化。酶以二聚体和四聚体形式存在。该酶与豌豆应激SDR、毛地黄Δ5-3β-羟基类固醇脱氢酶、亚麻籽和鬼臼的secoisolariciresinol脱氢酶分别具有53%、48%、43%和41%的序列同一性
  5. 与薄荷单萜还原酶仅约13%同一性

研究结论

异胡椒烯醇/香芹醇脱氢酶属于短链脱氢酶/还原酶（SDR）超家族，催化单萜醇的氧化；薄荷和留兰香的单萜氧化还原酶基因来自不同的祖先，并非由共同祖先基因简单复制分化而来