An Integrative Volatile Terpenoid Profiling and Transcriptomics Analysis for Gene Mining and Functional Characterization of AvBPPS and AvPS Involved in the Monoterpenoid Biosynthesis in Amomum villosum
- 作者
- Hong Wang, Dongming Ma, Jinfen Yang, Ke Deng, Meng Li, Xiaoyu Ji, Liting Zhong, Haiying Zhao
- 单位
- Research Center of Chinese Herbal Resource Science and Engineering, Guangzhou University of Chinese Medicine; Key Laboratory of Chinese Medicinal Resource from Lingnan, Ministry of Education; Joint Laboratory of National Engineering Research Center for the Pharmaceutics of Traditional Chinese Medicines, Guangzhou, China
- 杂志
- Frontiers in Plant Science（2018）
- DOI
- 10.3389/fpls.2018.00846
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阳春砂（Amomum villosum）的挥发性萜类活性成分（如乙酸龙脑酯）生物合成的下游基因尚不明确，需要从代谢组和转录组中挖掘并功能鉴定参与单萜生物合成的萜类合酶基因。
研究策略
整合挥发性萜类代谢组学与转录组学分析，通过KEGG注释、同源比对和相关性网络筛选候选TPS基因；对关键候选基因进行全长cDNA克隆、原核表达与体外酶活测定，并通过qRT-PCR和亚细胞定位验证其功能与表达模式。
核心内容
本研究以阳春砂为对象，整合挥发性萜类代谢组学与转录组学分析，旨在挖掘并功能鉴定参与单萜生物合成的关键酶基因。通过对不同组织及发育阶段的代谢谱和转录谱进行关联分析，从10个候选TPS基因中克隆出AvBPPS和AvPS两个单萜合酶，并在大肠杆菌中异源表达、纯化后测定体外酶活。结果显示，单萜占总挥发性萜类的92.25%，近成熟种子中乙酸龙脑酯相对含量最高达50.35%；AvBPPS催化GPP生成龙脑基二磷酸，脱磷酸后主产物为龙脑（65.91%），而AvPS主要生成α-蒎烯和β-蒎烯，其Km为1.99 μM，Kcat/Km为5.48×10³ M⁻¹ s⁻¹。qRT-PCR表明AvBPPS在幼嫩种子中表达量约为叶片的400倍，亚细胞定位显示两酶均定位于质体。AvBPPS被确认为乙酸龙脑酯生物合成的关键酶，AvPS可能参与生物防御，研究为阳春砂品质改良及乙酸龙脑酯异源合成提供了重要基因资源。
创新点
首次对阳春砂不同组织及发育阶段的挥发性萜类进行全面代谢谱与转录组整合分析；从10个候选TPS基因中克隆并功能鉴定了AvBPPS和AvPS两个单萜合酶，明确AvBPPS为乙酸龙脑酯生物合成的关键酶，AvPS可能参与生物防御；为通过代谢工程改良阳春砂品质和异源合成乙酸龙脑酯提供了基因资源。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌 Rosetta(DE3) | 单萜生物合成途径 | AvTPS1 (AvPS) | AvPS (pinene synthase) | 催化 | 重组蛋白催化GPP生成α-蒎烯(36.69%)和β-蒎烯(63.31%) |
| 大肠杆菌 Rosetta(DE3) | 单萜生物合成途径 | AvTPS3 (AvBPPS) | AvBPPS (bornyl diphosphate synthase) | 催化 | 重组蛋白催化GPP生成龙脑基二磷酸（主要产物），脱磷酸后检测到龙脑(65.91%)、莰烯(17.31%)、柠檬烯(13.14%)和β-月桂烯(3.63%) |
| 烟草（Nicotiana tabacum）叶肉原生质体 | 单萜生物合成途径 | AvTPS1 和 AvTPS3 完整ORF | AvPS-eGFP 和 AvBPPS-eGFP 融合蛋白 | 区室化 | 亚细胞定位显示两种蛋白均定位于质体（叶绿体） |
关键发现
- 鉴定出15种单萜和9种倍半萜，单萜占总挥发性萜类的92.25%，倍半萜占7.75%
- 近成熟种子（75 DAF）中乙酸龙脑酯相对含量最高，达50.35%
- AvTPS1（AvPS）催化GPP生成α-蒎烯（36.69%）和β-蒎烯（63.31%），其Km为1.99 μM，Kcat/Km为5.48×10^3 M^-1 s^-1
- AvTPS3（AvBPPS）催化GPP生成龙脑基二磷酸为主产物，脱磷酸处理后产物为龙脑（65.91%）、莰烯（17.31%）、柠檬烯（13.14%）和β-月桂烯（3.63%）
- AvBPPS在幼嫩种子中的表达量约为叶片的400倍，约为近成熟种子的20倍
- AvPS和AvBPPS均定位于质体（叶绿体）。
研究结论
AvBPPS是阳春砂种子中乙酸龙脑酯生物合成的关键酶，AvPS可能参与植物生物防御；本研究为阳春砂品质改良及乙酸龙脑酯的异源合成提供了理论基础和基因资源。