Evolution of the Isoprene Biosynthetic Pathway in Kudzu
- 作者
- Thomas D. Sharkey, Sansun Yeh, Amy E. Wiberley, Tanya G. Falbel, Deming Gong, Donna E. Fernandez
- 单位
- Department of Botany, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin 53706; Protemix Corporation, University of Auckland, Auckland City, New Zealand
- 杂志
- Plant Physiology（2005）
- DOI
- 10.1104/pp.104.054445
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
探究异戊二烯生物合成途径中MEP途径基因与异戊二烯合酶的进化保守性差异，以及异戊二烯合酶从萜烯合酶家族中演化而来的机制。
研究策略
克隆葛根和杨树中MEP途径基因（DXS、DXR、Idi）和异戊二烯合酶基因，通过序列比对、系统发育分析、蛋白结构建模，并在拟南芥中异源表达验证功能。
核心内容
该研究以葛根为材料，系统探究了异戊二烯生物合成途径中MEP途径基因与异戊二烯合酶的进化差异。研究克隆了葛根MEP途径的DXS、DXR、Idi基因以及异戊二烯合酶基因，通过序列比对、系统发育分析和蛋白结构建模分析其进化关系，并在拟南芥中异源表达验证功能。结果显示，MEP途径基因在葛根与拟南芥间高度保守，DXS成熟蛋白同一性达89%，DXR为80%，而葛根与杨树的异戊二烯合酶蛋白同一性仅54%。酶学表征表明葛根异戊二烯合酶Km为7.7 mM，Hill系数为4.1。转基因拟南芥获得异戊二烯释放能力，平均释放速率达1.32 nmol m⁻² s⁻¹。结构建模发现活性位点两个特有的苯丙氨酸残基使活性口袋变小，可能决定对DMAPP的特异性。该研究证明MEP途径基因进化保守，而异戊二烯合酶快速进化且在被子植物中可能单次起源；异戊二烯合酶是决定植物释放异戊二烯的关键因素，单基因导入即可赋予非释放植物释放能力，为通过代谢工程改造植物异戊二烯释放提供了理论依据。
创新点
['首次克隆葛根异戊二烯合酶基因', '鉴定出异戊二烯合酶活性位点特有的两个苯丙氨酸残基', '证明异戊二烯合酶单基因足以使非释放型植物获得异戊二烯释放能力']
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 葛根（Pueraria montana） | MEP途径 | DXS | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | cDNA长度2679 bp，编码717氨基酸，预测77.6 kD，含45氨基酸转运肽 |
| 葛根（Pueraria montana） | MEP途径 | DXR | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 | 催化 | cDNA长度1788 bp，编码465氨基酸，预测50.6 kD，含44氨基酸转运肽 |
| 葛根（Pueraria montana） | MEP途径 | Idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | cDNA长度1252 bp，编码301氨基酸，预测34.2 kD，含71氨基酸转运肽 |
| 葛根（Pueraria montana） | 异戊二烯合成途径 | IspS | 异戊二烯合酶 | 催化 | cDNA长度1824 bp，编码608氨基酸，预测70 kD，含44氨基酸转运肽；基因组序列3139 bp |
| 杨树（Populus tremuloides） | 异戊二烯合成途径 | IspS | 异戊二烯合酶 | 催化 | cDNA长度1785 bp，编码595氨基酸，预测69 kD，含45氨基酸转运肽；基因组序列5324 bp |
| 大肠杆菌（Escherichia coli BL21(DE3)） | 异戊二烯合成途径 | IspS | 异戊二烯合酶 | 催化 | 重组表达葛根异戊二烯合酶（带His标签），测得kcat为0.088 mol mol^-1 s^-1，Km为7.7 mM，Hill系数4.1 |
| 拟南芥（Arabidopsis thaliana ecotype Wassilewskija） | 异戊二烯合成途径 | IspS | 异戊二烯合酶 | 催化 | 转入葛根基因组IspS基因（含276 bp上游序列），转基因植株释放异戊二烯，平均速率1.32 nmol m^-2 s^-1 |
关键发现
- MEP途径基因在葛根与拟南芥间高度保守（DXS成熟蛋白89%同一性，DXR 80%，Idi 87%/90%）
- 异戊二烯合酶基因在葛根与杨树间仅54%蛋白同一性（去除转运肽后57%）。葛根异戊二烯合酶Km为7.7 mM，Hill系数4.1，kcat为0.088 mol mol^-1 s^-1。转基因拟南芥释放异戊二烯速率平均1.32 nmol m^-2 s^-1（范围0.88-1.7）。异戊二烯合酶基因含7个外显子和6个内含子。活性位点两个苯丙氨酸残基使活性口袋变小，可能决定对DMAPP的特异性。
研究结论
MEP途径基因在进化上高度保守，而异戊二烯合酶基因则快速进化，可能在被子植物中单次起源、在裸子植物中独立起源；异戊二烯合酶是决定植物是否释放异戊二烯的关键因素，将该基因导入非释放植物即可赋予其释放能力。