高级醇 · 代谢工程文献库

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Monoterpene Metabolism. Cloning, Expression, and Characterization of Menthone Reductases from Peppermint 1

作者
Edward M. Davis, Kerry L. Ringer, Marie E. McConkey, Rodney Croteau
单位
Institute of Biological Chemistry, Washington State University, Pullman, Washington 99164-6340
杂志
Plant Physiology（2005）
DOI
10.1104/pp.104.053306
所属领域
代谢工程
关键词
NADPH依赖酮还原酶单萜代谢油腺短链脱氢酶/还原酶薄荷薄荷酮还原酶薄荷醇
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解决的核心问题

克隆并表征薄荷中催化薄荷酮还原为薄荷醇的两个立体特异性酮还原酶（MMR和MNR），阐明薄荷醇生物合成最后步骤的分子基础，为代谢工程改良薄荷油品质提供基因工具。

研究策略

利用未成熟薄荷油腺EST文库，通过大肠杆菌原位功能筛选获得MNR cDNA；利用成熟油腺分泌细胞mRNA，基于MMR与MNR及异胡薄荷酮还原酶保守序列设计引物，通过RT-PCR和RACE克隆MMR cDNA，并在大肠杆菌中异源表达、纯化后进行酶学表征。

研究路线图

100%
研究问题：克隆薄荷酮还原酶，阐明薄荷醇合成最后步骤分子基础
策略1：未成熟油腺EST文库+大肠杆菌原位功能筛选获得MNR cDNA
策略2：成熟油腺mRNA + RT-PCR/RACE克隆MMR cDNA
关键改造：大肠杆菌BL21(DE3)异源表达MMR/MNR并纯化
结果1：MNR催化薄荷酮→94%新薄荷醇、6%薄荷醇，Km=674μM，pH9.3
结果2：MMR催化薄荷酮→95%薄荷醇、5%新薄荷醇，Km=3μM，pH7.0
结果3：两酶同源性73%，覆盖所有薄荷醇异构体，推测细胞质定位
结论：获薄荷酮还原酶基因工具，过表达可增薄荷醇产量、支持两季采收
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核心内容

该研究从薄荷（Mentha × piperita）中克隆并异源表达了两个催化薄荷酮还原的立体特异性酮还原酶，分别命名为MMR和MNR，从而阐明了薄荷醇生物合成最后步骤的分子基础。MNR通过对未成熟油腺EST文库进行大肠杆菌原位功能筛选获得，MMR则基于与MNR及异胡薄荷酮还原酶的保守序列通过RT-PCR和RACE克隆，随后在大肠杆菌中表达纯化并进行酶学表征。结果显示，MMR将(-)-薄荷酮还原为95%的(-)-(3R)-薄荷醇，对薄荷酮的Km为3.0 μM，kcat为0.6 s⁻¹；MNR则将(-)-薄荷酮还原为94%的(+)-(3S)-新薄荷醇，对薄荷酮的Km为674 μM，kcat为0.06 s⁻¹。两个酶的立体选择性产物恰好覆盖了薄荷油中全部薄荷醇异构体，其氨基酸序列一致性为73%。上述发现明确了薄荷酮还原步骤的催化机制，为通过代谢工程过表达这两个基因以提升幼嫩植株中(-)-薄荷醇产量、实现每季两次采收高品质薄荷油提供了基因工具。

创新点

首次克隆并功能表达(-)-薄荷酮还原酶（MMR）和(+)-新薄荷醇还原酶（MNR）；采用原位活性筛选与同源序列克隆相结合的策略；揭示了两个还原酶的立体选择性催化特性及动力学参数，并推测其细胞质定位。

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Mentha x piperita 薄荷醇生物合成 MMR (AY288138) (-)-薄荷酮:(-)-(3R)-薄荷醇还原酶 催化 NADPH依赖性酮还原酶，将(-)-薄荷酮还原为(-)-薄荷醇，定位于细胞质，pH最适7.0
Mentha x piperita 薄荷醇生物合成 MNR (AY288137) (-)-薄荷酮:(+)-(3S)-新薄荷醇还原酶 催化 NADPH依赖性酮还原酶，将(-)-薄荷酮还原为(+)-新薄荷醇，定位于细胞质，pH最适9.3
Escherichia coli BL21(DE3) 异源重组表达 MMR (AY288138) 重组薄荷酮:(-)-(3R)-薄荷醇还原酶 催化 用于功能鉴定和动力学表征，未加His标签的酶Km(NADPH)为0.12 μM
Escherichia coli BL21(DE3) 异源重组表达 MNR (AY288137) 重组薄荷酮:(+)-(3S)-新薄荷醇还原酶 催化 通过原位筛选获得，重组酶催化活性与天然酶一致

关键发现

  1. MNR重组酶将(-)-薄荷酮还原为94% (+)-(3S)-新薄荷醇和6% (-)-(3R)-薄荷醇，将(+)-异薄荷酮还原为86% (+)-(3S)-异薄荷醇和14% (+)-(3R)-新异薄荷醇
  2. pH最适9.3
  3. Km值分别为薄荷酮674 μM、异薄荷酮>1 mM、NADPH 10 μM，kcat为0.06 s⁻¹。MMR重组酶将(-)-薄荷酮还原为95% (-)-(3R)-薄荷醇和5% (+)-(3S)-新薄荷醇，将(+)-异薄荷酮还原为87% (+)-(3R)-新异薄荷醇和13% (+)-(3S)-异薄荷醇
  4. pH最适7.0
  5. Km值分别为薄荷酮3.0 μM、异薄荷酮41 μM、NADPH 0.12 μM，kcat为0.6 s⁻¹。MMR和MNR的氨基酸序列一致性为73%，推测分子量分别为34,070 D和35,722 D。两个还原酶的立体选择性产物覆盖了薄荷油中所有薄荷醇异构体。

研究结论

克隆并表征了薄荷酮还原酶MMR和MNR，它们负责薄荷油中(-)-薄荷醇及其异构体的生成；这两个基因的过表达有望提高幼嫩植株中(-)-薄荷醇的产量，支持实现每季两次采收高品质薄荷油。