Antisense Suppression of a (+)-δ-Cadinene Synthase Gene in Cotton Prevents the Induction of This Defense Response Gene during Bacterial Blight Infection But Not Its Constitutive Expression
- 作者
- Belinda J. Townsend, Andrew Poole, Christopher J. Blake, Danny J. Llewellyn
- 单位
- Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation- Plant Industry; Department of Biochemistry and Molecular Biology, Australian National University; Research School of Chemistry, Australian National University
- 杂志
- Plant Physiology（2005）
- DOI
- 10.1104/pp.104.056010
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
通过反义抑制棉花中的(+)-δ-cadinene synthase (CDNS)基因，试图降低种子中棉酚等倍半萜含量，并探究CDNS多基因家族在防御反应中的功能分化。
研究策略
从棉花发育胚中分离CDNS cDNA克隆并功能表征，构建组成型(35S)和种子特异性(lectin)启动子驱动的反义表达载体，经农杆菌介导转化棉花，分析转基因种子棉酚含量以及受Xanthomonas campestris pv. malvacearum和Verticillium dahliae感染时的CDNS表达变化。
核心内容
该研究针对棉花中编码(+)-δ-cadinene synthase（CDNS）的多基因家族，试图通过反义抑制降低种子棉酚等倍半萜含量，并探究该家族在防御反应中的功能分化。作者从发育胚中分离CDNS cDNA并完成功能表征，构建了由组成型35S或种子特异性lectin启动子驱动的反义表达载体，经农杆菌介导转化棉花，随后分析转基因种子棉酚含量及受细菌性枯萎病菌和黄萎病菌感染时的CDNS表达变化。重组CDNS酶比活力为2,922 nmol ³H FPP mg⁻¹ h⁻¹，Km为10.6 μM FPP。结果显示，所有反义转基因系的种子游离棉酚含量均未降低，其中35SC6as 23反而比未转化对照（1.301%）高出64%，达2.133%。在35S反义植株中，细菌性枯萎病菌诱导的CDNS转录本和蛋白在36小时内被完全阻断，而黄萎病菌感染48小时后表达仍正常。这表明一个特定CDNS基因（cdn1-C4）专门参与细菌性枯萎病诱导的防御反应，但不影响组成型表达或黄萎病菌响应。该发现揭示了CDNS多基因家族成员具有复杂的时空调控和功能分化，仅抑制单个基因不足以降低种子棉酚，也为理解植物抗病与次生代谢间的精细分工提供了新视角。
创新点
发现一个CDNS基因(cdn1-C4)特异性参与细菌性枯萎病诱导的防御反应，而不影响组成型表达或Verticillium诱导的防御反应；揭示了CDNS多基因家族在时间和空间上的复杂调控及功能分化。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 棉花（Gossypium hirsutum cv Coker 315） | cadinane型倍半萜生物合成（棉酚及cadalene衍生物） | cdn1-C4（反义构建体）及CDNS多基因家族 | (+)-δ-cadinene synthase (CDNS) | 催化 | 组成型和种子特异性反义抑制，分析种子棉酚含量及病原菌诱导的CDNS表达 |
| 大肠杆菌BL21(DE3) | 异源表达倍半萜环化酶 | cdn1-C4 | 重组CDNS（N端His标签） | 催化 | 酶学表征（比活力、Km、kcat）及产物鉴定为(+)-δ-cadinene |
| 棉花（Gossypium hirsutum） | cadinane型倍半萜生物合成 | cdn1-C5, cdn1-D1, cdn1-C6, cdn1-C7, cdn1-C8 | CDNS及相关假基因产物 | 催化 | 基因组克隆鉴定，包括功能性基因和多个假基因 |
关键发现
- 重组CDNS酶比活力为2,922 nmol ³H FPP mg⁻¹ h⁻¹，Km为10.6 μM FPP，kcat为0.027 s⁻¹
- 棉花种子游离棉酚含量在未转化Coker 315中为1.301%±0.026%，反义转基因系35SC6as 23为2.133%±0.063%（比对照高64%），35SC6as 51为1.561%±0.122%，LeC6as 3为1.575%±0.058%，其他系为1.329%–1.447%，均未降低
- 在35S反义植株中，Xcm诱导的CDNS转录本和蛋白在36 h内完全被阻断，而V. dahliae感染48 h后CDNS表达仍正常诱导
- 讨论中提到细菌性枯萎病感染时CDNS诱导超过500倍。
研究结论
cdn1-C4可能专门参与细菌性枯萎病防御反应，CDNS多基因家族成员具有不同的时空调控和功能分支，仅抑制单个CDNS基因不足以降低种子棉酚含量或影响Verticillium诱导的防御反应。