Maize cDNAs Expressed in Endosperm Encode Functional Farnesyl Diphosphate Synthase with Geranylgeranyl Diphosphate Synthase Activity
- 作者
- Miguel Cervantes-Cervantes, Cynthia E. Gallagher, Changfu Zhu, Eleanore T. Wurtzel
- 单位
- Department of Biological Sciences, Lehman College, City University of New York, Bronx, New York 10468; Graduate School and University Center, City University of New York, New York, New York 10016
- 杂志
- Plant Physiology（2006）
- DOI
- 10.1104/pp.106.077008
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
玉米胚乳中编码异戊二烯合酶的cDNA功能鉴定，意外发现具有FPPS和GGPPS双功能的酶，揭示其产物特异性调控机制。
研究策略
利用大肠杆菌中来自Erwinia uredovora的类胡萝卜素基因簇缺失crtE进行功能互补筛选，分离玉米胚乳cDNA；结合序列分析、体外放射性酶活测定、N端截短和pH影响分析，研究酶的双功能特性。
核心内容
该研究从玉米胚乳cDNA文库中筛选并鉴定了编码法尼基焦磷酸合酶（FPPS）的基因，意外发现其具有天然的双功能催化活性，既能合成法尼基焦磷酸（FPP），又能生成香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）。研究者利用大肠杆菌中来自Erwinia uredovora的类胡萝卜素基因簇缺失crtE进行功能互补筛选，从约30,000个菌落中获得6个黄色互补克隆，其中长克隆pME14D1184和短克隆pME14D1268使类胡萝卜素产量分别达到阴性对照的67倍和55倍，但低于龙胆GGPPS阳性对照约8–10倍。体外放射性酶活测定表明，长克隆的FPP/GGPP产物比值为114，短克隆为10.4，而橡胶树GGPPS仅为0.59；N端截短可使GGPP产量相对增加约11倍，表明N端序列显著影响产物比例。该基因家族至少含3个成员，定位于玉米8L、3L和6L染色体，转录本约1.5kb，在授粉后15至20天才可检测到。该研究首次报道天然FPPS具备双功能活性，并证明其能在异源体系中与类胡萝卜素途径偶联，为异戊二烯代谢工程提供了新的基因资源。
创新点
首次发现天然FPPS具有双功能（FPPS/GGPPS）活性；证明N端序列影响产物比例；通过功能互补证明该酶可与异源代谢途径偶联，为代谢工程提供新工具。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli TOP10F | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtE（缺失） | CrtE（GGPPS） | 催化 | pACCAR25ΔcrtE用于功能互补筛选，缺失GGPPS活性导致无法积累类胡萝卜素 |
| Escherichia coli TOP10F | 异戊二烯生物合成途径 | 玉米fpps（pME14D1184、pME14D1268等） | 玉米FPPS（兼具GGPPS活性） | 催化 | 分离自玉米B73胚乳cDNA文库，可互补ΔcrtE，产生GGPP并驱动类胡萝卜素合成 |
| Escherichia coli | 异戊二烯生物合成途径 | ispA | 大肠杆菌FPPS | 催化 | 作为阴性对照的背景来源，提供微量GGPP |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtE（来自Erwinia uredovora） | CrtE（GGPPS） | 催化 | pACCAR25阳性对照，保证类胡萝卜素合成 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成途径 | ggpps（来自Gentiana lutea） | 龙胆GGPPS | 催化 | pUCggpps阳性对照，验证互补体系 |
| Escherichia coli | 异戊二烯生物合成途径 | fps（来自Gentiana lutea） | 龙胆FPPS | 催化 | pBS-FPS阴性对照，产量远低于玉米克隆 |
| Escherichia coli | 异戊二烯生物合成途径 | ggpps（来自Hevea brasiliensis） | 橡胶树GGPPS | 催化 | pHBGG6对照，体外产物以GGPP为主 |
| 玉米（Zea mays L. cv B73） | 异戊二烯生物合成途径 | fpps基因家族 | FPPS | 催化 | 胚乳中表达，转录本约1.5kb，15-20 DAP积累，基因家族至少3个成员 |
关键发现
- 筛选约30,000个菌落获得6个黄色互补克隆
- 长克隆pME14D1184和短克隆pME14D1268分别使类胡萝卜素产量达到阴性对照的67倍和55倍
- G.lutea GGPPS阳性对照为552倍，比玉米克隆高8-10倍
- 与G.lutea FPPS相比，玉米长克隆和短克隆分别高19倍和16倍
- 体外酶活测定显示长克隆FPP/GGPP比值为114，短克隆为10.4，H.brasiliensis GGPPS为0.59，N端截短使GGPP产量相对增加约11倍
- 酶在pH6.5-10.5均有活性，pH10.5时总合成显著下降
- 基因家族至少3个成员，定位在8L、3L、6L染色体
- 转录本约1.5kb，15和20 DAP才可检测到。
研究结论
玉米胚乳cDNA编码的FPPS具有天然的双功能催化活性，能同时产生FPP和GGPP，且N端序列调控产物比例。该酶可在异源体系中与类胡萝卜素途径偶联，为异戊二烯代谢工程提供了新的基因资源。