Molecular Cloning and Characterization of a Vacuolar Class III Peroxidase Involved in the Metabolism of Anticancer Alkaloids in Catharanthus roseus
- 作者
- Maria Manuela R. Costa, Frederique Hilliou, Patricia Duarte, Luis Gustavo Pereira, Iolanda Almeida, Mark Leech, Johan Memelink, Alfonso Ros Barceló, Mariana Sottomayor
- 单位
- John Innes Centre, Norwich NR4 7UH, United Kingdom; IBMIC - Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade do Porto, 4150-180 Porto, Portugal; Department of Botany of Faculty of Sciences, Universidade do Porto, 4150-180 Porto, Portugal; Institute of Biology, Clusius Laboratory, Leiden University, 2333 AL Leiden, The Netherlands; Department of Plant Biology (Plant Physiology), University of Murcia, E-30100 Murcia, Spain
- 杂志
- Plant Physiology（2007）
- DOI
- 10.1104/pp.107.107060
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
克隆并表征长春花中参与抗癌生物碱（长春碱、长春新碱）生物合成的关键酶——液泡III类过氧化物酶CrPrx1，并确证其亚细胞定位和功能。
研究策略
通过蛋白纯化、Edman降解和质谱获得多肽序列，结合简并PCR、cDNA文库筛选和RACE克隆cDNA；通过基因组PCR和Southern blot分析基因结构；通过系统发育分析研究其进化关系；通过GFP融合蛋白在长春花悬浮细胞中瞬时表达验证液泡定位；通过Northern blot、酶活测定和生物碱含量分析研究表达与代谢的相关性。
核心内容
该研究从长春花叶片中克隆并功能鉴定了液泡III类过氧化物酶CrPrx1，证实其参与抗癌生物碱长春碱和长春新碱生物合成的关键二聚化步骤。通过蛋白纯化、Edman降解、简并PCR及cDNA文库筛选等方法获得全长cDNA，其编码363个氨基酸的预蛋白，成熟蛋白含304个氨基酸，分子量约33.7 kDa，糖基化修饰占17%至24%。基因组分析表明该基因为单拷贝，含两个内含子。GFP融合实验证实CrPrx1定位于液泡，且C端延伸序列对液泡分选必不可少。表达模式分析显示其在幼叶和衰老叶中高表达，与萜类吲哚生物碱途径基因Str和D4h的表达模式一致。体外酶活实验表明，2 μM CrPrx1在300 μM vindoline、400 μM catharanthine和330 μM H2O2条件下，30分钟时anhydrovinblastine产量达到峰值，随后因进一步氧化而下降。该研究首次克隆了长春花叶片中主要的液泡III类过氧化物酶，揭示其作为二聚化关键酶的功能，为利用代谢工程提高植物抗癌生物碱含量提供了重要靶点。
创新点
首次克隆了长春花叶片中主要III类过氧化物酶CrPrx1的全长cDNA和基因，证实其具有anhydrovinblastine合成酶活性并定位于液泡；揭示了其属于液泡III类过氧化物酶的一个古老进化分支；表达与代谢物分析表明其是生物碱二聚化反应的关键酶，可作为提高植物中抗癌生物碱含量的靶点。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus | 萜类吲哚生物碱生物合成途径 | CrPrx1 | CrPrx1 (III类过氧化物酶) | 催化 | 催化vindoline和catharanthine偶联生成α-3',4'-anhydrovinblastine |
| Catharanthus roseus | 萜类吲哚生物碱生物合成途径 | Str | strictosidine synthase | 催化 | 途径早期酶，作为表达对比 |
| Catharanthus roseus | 萜类吲哚生物碱生物合成途径 | D4h | desacetoxyvindoline 4-hydroxylase | 催化 | 途径后期酶，作为表达对比 |
| Catharanthus roseus suspension cells | — | — | GFP-CrPrx1融合蛋白 | 区室化 | 验证CrPrx1定位于液泡 |
关键发现
- CrPrx1 cDNA全长1,388 bp，编码363个氨基酸的预蛋白，包含34个氨基酸的N端信号肽和约23-25个氨基酸的C端延伸
- 成熟蛋白为304个氨基酸，计算分子量为33,751，糖基化占17%-24%。该基因在长春花基因组中为单拷贝，含有两个内含子，内含子I长828 bp，内含子II约3.5-4 kb。CrPrx1与拟南芥AtPrx12氨基酸序列一致性最高（60%）。GFP融合实验证实其定位于液泡，且C端延伸是液泡分选所必需的。表达分析显示CrPrx1在幼叶和衰老叶中高表达，与TIA途径基因（Str、D4h）表达模式类似。在16周龄植株的叶片中，CrPrx1活性随叶龄增加，同时伴随vindoline和catharanthine含量下降和AVLB含量升高。体外酶活实验表明，2 μM CrPrx1在300 μM vindoline、400 μM catharanthine和330 μM H2O2存在下，30分钟时AVLB产量达到峰值，随后因进一步氧化而下降。
研究结论
CrPrx1是长春花叶片中主要的液泡III类过氧化物酶，催化vindoline和catharanthine偶联生成AVLB，是抗癌生物碱长春碱和长春新碱生物合成的关键步骤。该酶定位于液泡，其表达模式与生物碱代谢相关，是代谢工程改造提高植物抗癌生物碱含量的潜在靶标。