Saponin Biosynthesis in Saponaria vaccaria. cDNAs Encoding β-Amyrin Synthase and a Triterpene Carboxylic Acid Glucosyltransferase
- 作者
- Dauenpen Meesapyodsuk, John Balsevich, Darwin W. Reed, Patrick S. Covello
- 单位
- Plant Biotechnology Institute, Saskatoon, Saskatchewan, Canada S7N OW9
- 杂志
- Plant Physiology（2007）
- DOI
- 10.1104/pp.106.088484
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并鉴定Saponaria vaccaria中参与三萜皂苷生物合成的关键酶基因，包括β-香树脂醇合酶和三萜羧酸葡萄糖基转移酶，以阐明其单去糖苷皂苷的生物合成途径。
研究策略
采用简并PCR与EST测序相结合的策略，从S. vaccaria中克隆候选cDNA；通过异源表达（酿酒酵母和大肠杆菌）对基因产物进行功能表征，包括产物鉴定、底物特异性及酶动力学分析。
核心内容
该研究从麦瓶草（Saponaria vaccaria）中克隆并功能鉴定了三萜皂苷生物合成的两个关键酶基因。研究采用简并PCR与EST测序策略获得候选cDNA，并分别在酿酒酵母和大肠杆菌中异源表达进行功能表征。β-香树脂醇合酶（SvBS）的开放阅读框为2283 bp，编码87.5 kD蛋白，在酵母中表达经GC-MS确认生成β-amyrin，且该基因在叶片中高表达。葡萄糖基转移酶UGT74M1编码478个氨基酸，在大肠杆菌中纯化产量约1 mg/L，纯度超过80%。酶学分析显示，UGT74M1以UDP-葡萄糖为糖供体，对多种齐墩果烷型三萜羧酸进行C-28位酯化糖基化，其中对16α-羟基gypsogenic acid相对活性最高（177%），对gypsogenic acid的Km为170 μM，kcat/Km为6.5×10³，而对16-羟基底物的催化效率达2.5×10⁴。NMR证实产物为三萜C-28位葡萄糖酯。该研究阐明了单去糖苷皂苷合成的关键步骤，表明UGT74M1的底物特异性可能构成单双去糖苷途径的分支调控点，为三萜皂苷的异源生产提供了重要酶学基础。
创新点
首次从Saponaria vaccaria中克隆并功能鉴定了β-香树脂醇合酶（SvBS）和三萜羧酸葡萄糖基转移酶（UGT74M1）；揭示UGT74M1属于UGT74家族，能以UDP-葡萄糖为糖供体，对多种齐墩果烷型三萜羧酸进行C-28位酯化糖基化，参与单去糖苷皂苷的生物合成。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 三萜皂苷生物合成 | SvBS | β-香树脂醇合酶 (SvBS) | 催化 | 在酿酒酵母中异源表达，催化2,3-氧化鲨烯环化生成β-amyrin；基因主要在叶片中表达。 |
| 大肠杆菌 (Escherichia coli) | 三萜皂苷生物合成 | UGT74M1 | UDP-葡萄糖:三萜羧酸葡萄糖基转移酶 (UGT74M1) | 催化 | 在大肠杆菌中异源表达并纯化，以UDP-葡萄糖为糖供体，催化三萜羧酸C-28位酯化糖基化；底物包括gypsogenic acid、gypsogenin等。 |
关键发现
- SvBS cDNA开放阅读框为2,283 bp，编码760个氨基酸的87.5 kD蛋白
- 与甘草、蒺藜苜蓿、拟南芥的β-香树脂醇合酶氨基酸序列一致性分别为81%、80%、72%。SvBS在酿酒酵母中表达产生β-amyrin，经GC-MS确认。SvBS基因在叶片中高表达，根和萌发种子中表达较低。UGT74M1 cDNA编码478个氨基酸，预测分子量为53.3 kD
- 基因组中含一个354 bp的内含子。UGT74M1在大肠杆菌中表达并纯化，产量约1 mg/L培养物，纯度>80%。底物特异性相对活性：16α-羟基gypsogenic acid为177%，gypsogenic acid为100%，gypsogenin为22%，quillaic acid为19%，echinocystic acid为9%，hederagenin为4.5%，betulinic acid为2.5%
- 对β-amyrin、oleanolic acid等无活性。酶学性质：最适温度30°C，最适pH 7.5，不依赖MgCl2。动力学常数：gypsogenic acid Km为170 μM，kcat为1.13 s^-1，kcat/Km为6.5×10^3 s^-1 μM^-1
- 16-羟基gypsogenic acid Km为51 μM，kcat为1.29 s^-1，kcat/Km为2.5×10^4
- gypsogenin Km为42 μM，kcat为0.125 s^-1
- quillaic acid Km为37 μM，kcat为0.111 s^-1。NMR证实UGT74M1催化生成的产物为三萜C-28位葡萄糖酯。
研究结论
本研究鉴定了S. vaccaria中两个参与三萜皂苷生物合成的酶：SvBS催化2,3-氧化鲨烯环化生成β-香树脂醇，UGT74M1催化三萜羧酸C-28位葡萄糖酯化。表达模式及底物特异性表明UGT74M1特异使用UDP-葡萄糖，参与单去糖苷皂苷的合成，可能代表单、双去糖苷途径的分支点。