Molecular Cloning and Characterization of a cDNA for Pterocarpan 4-Dimethylallyltransferase Catalyzing the Key Prenylation Step in the Biosynthesis of Glyceollin, a Soybean Phytoalexin
- 作者
- Tomoyoshi Akashi, Kanako Sasaki, Toshio Aoki, Shin-ichi Ayabe, Kazufumi Yazaki
- 单位
- Department of Applied Biological Sciences, Nihon University, Fujisawa, Kanagawa 252-8501, Japan; Laboratory of Plant Gene Expression, Research Institute for Sustainable Humanosphere, Kyoto University, Gokasho, Uji 611-0011, Japan
- 杂志
- Plant Physiology（2008）
- DOI
- 10.1104/pp.108.123679
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
大豆glyceollin生物合成中关键异戊烯基化步骤的酶基因一直未被鉴定，该步骤催化pterocarpan骨架与二甲基allyl基团的结合，是合成glyceollin I的直接前体形成步骤。
研究策略
通过大豆EST库同源搜索（以拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶VTE2-1为查询序列），筛选出候选基因PT2，克隆其全长cDNA并在酿酒酵母中异源表达，利用体外酶活测定验证功能；结合基因表达分析、亚细胞定位（GFP融合蛋白）和[1-13C]Glc同位素示踪实验阐明其生物学作用。
核心内容
该研究首次从大豆中克隆并鉴定了催化glyceollin生物合成关键异戊烯基化步骤的pterocarpan 4-二甲基烯丙基转移酶基因G4DT。通过以拟南芥VTE2-1为查询序列进行EST同源搜索获得候选基因PT2，将其全长cDNA在酿酒酵母中异源表达，重组酵母微粒体酶活性达512 pmol mg protein⁻¹ s⁻¹，约为大豆细胞的400倍。酶动力学分析显示，G4DT对底物(-)-glycinol的Km为68 μM，对DMAPP为150 μM。基因表达分析表明，酵母提取物诱导后G4DT在5-10小时表达上调，glyceollin I在48小时积累至154 μmol/L。GFP融合蛋白定位实验证实G4DT定位于质体，[1-13C]Glc同位素示踪进一步证明其异戊烯基供体来源于MEP途径。该研究填补了glyceollin生物合成后期关键酶基因鉴定的空白，为大豆植保素代谢途径的完整解析及异源重构提供了重要基础。
创新点
首次鉴定并克隆了pterocarpan特异性的异戊烯基转移酶G4DT，证明其定位于质体并通过MEP途径提供异戊烯基供体，填补了glyceollin生物合成后期关键酶基因的空白。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大豆 (Glycine max) | glyceollin生物合成 | G4DT (PT2) | G4DT (glycinol 4-dimethylallyltransferase) | 催化 | 催化DMAPP与(-)-glycinol的4位异戊烯基化，生成glyceollin I的直接前体4-dimethylallylglycinol，定位于质体。 |
| 酿酒酵母BJ2168 | 异源表达 | G4DT | G4DT | 催化 | 截短转运肽的重组酵母微粒体显示酶活性，全长形式无活性。 |
| 洋葱表皮细胞 | 亚细胞定位 | G4DT | G4DT(TP)-GFP融合蛋白 | 区室化 | N端44个氨基酸转运肽引导GFP定位于质体。 |
| 大豆 | glyceollin生物合成 | PT3 | PT3 | 催化 | 候选的glycinol 2-dimethylallyltransferase，与G4DT有61%氨基酸同源性。 |
| 大豆 | 维生素E/质体醌生物合成 | PT1 | PT1 | 催化 | 与VTE2-1高度同源（75%氨基酸同一性），属于叶绿基转移酶。 |
| 大豆培养细胞 | 异黄酮/植保素生物合成 | IFS1, IFS2, HID, P6aH | 2-羟基异黄酮合成酶, 2-羟基异黄酮脱水酶, 3,9-二羟基紫檀素6a-羟化酶 | 催化 | 与G4DT表达协同上调，参与glyceollin前体合成。 |
关键发现
- 克隆到编码G4DT的cDNA（AB434690），重组酵母微粒体酶活性为512±15 pmol mg protein^-1 s^-1，约为大豆细胞的400倍
- G4DT对(-)-glycinol的Km为68 μM，对DMAPP为150 μM
- 酵母提取物诱导后，G4DT基因在5-10小时表达上调，同时glyceollin I在48小时积累达154±9 μmol/L培养物体积
- 13C标记实验显示异戊烯基来自MEP途径
- G4DT定位于质体。
研究结论
G4DT是大豆glyceollin生物合成途径中催化关键异戊烯基化步骤的酶，该酶定位于质体，利用MEP途径的DMAPP，其基因表达受激发子诱导，且与glyceollin积累模式一致。