Cloning and Characterization of Naringenin 8-Prenyltransferase, a Flavonoid-Specific Prenyltransferase of Sophora flavescens
- 作者
- Kanako Sasaki, Kouji Mito, Kazuaki Ohara, Hirobumi Yamamoto, Kazufumi Yazaki
- 单位
- Laboratory of Plant Gene Expression, Research Institute for Sustainable Humanosphere, Kyoto University, Uji 611-0011, Japan; Plant Regulation Research Center, Faculty of Life Sciences, Toyo University, Gunma 374-0193, Japan
- 杂志
- Plant Physiology（2008）
- DOI
- 10.1104/pp.107.110544
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
尽管经过30多年的研究，植物中黄酮类化合物特异性异戊烯基转移酶的基因尚未被鉴定，阻碍了异戊烯基黄酮类化合物的生物工程应用。
研究策略
从苦参培养细胞cDNA文库中通过EST筛选（保守基序、跨膜结构域、质体转运肽预测）获得候选基因，在酵母中异源表达并筛选酶活性，进一步在拟南芥中异源表达验证体内功能。
核心内容
历经三十余年研究，植物中黄酮特异性异戊烯基转移酶的基因一直未被鉴定，阻碍了异戊烯基黄酮类活性成分的工程化生产。本研究从苦参培养细胞cDNA文库中，依据保守基序、跨膜结构域及质体转运肽预测筛选EST，获得候选基因SfN8DT-1，并在酿酒酵母中异源表达验证其酶活，随后在拟南芥中异源表达考察体内功能。结果显示，SfN8DT-1在酵母中表现出柚皮素8-二甲基烯丙基转移酶活性，活性为1.38±0.3 nmol h⁻¹ mg protein⁻¹，对DMAPP和柚皮素的Km值分别为106 μM和55 μM；底物特异性严格，仅接受柚皮素、甘草素和橙皮素。在转基因拟南芥中，可检测到8-二甲基烯丙基山柰酚（4.4 μg/g DW），补加100 μM柚皮素后进一步产生多种异戊烯基黄酮（最高达5.1 μg/g DW）。此外，该基因在苦参根皮中特异表达并可被茉莉酸甲酯等诱导。SfN8DT-1是首个从植物中鉴定的黄酮特异性异戊烯基转移酶，参与苦参酮G的生物合成，为异戊烯基黄酮的异源生产提供了关键基因工具。
创新点
首次从植物中鉴定黄酮特异性异戊烯基转移酶基因SfN8DT-1；发现其与维生素E/质体醌合成相关异戊烯基转移酶具有同源性但底物特异；证实了在非产异戊烯基黄酮的拟南芥中通过异源表达可产生异戊烯基黄酮。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 苦参培养细胞 | 苦参酮G（SFG）生物合成 | SfN8DT-1 | SfN8DT-1 | 催化 | 催化naringenin的8位二甲基烯丙基化，在根皮中特异表达 |
| 酿酒酵母 | 黄酮异戊烯化代谢 | SfN8DT-1 | SfN8DT-1 | 催化 | 异源表达后微体膜部分具有酶活性，依赖Mg2+和DMAPP |
| 拟南芥 | 黄酮代谢 | SfN8DT-1 | SfN8DT-1 | 催化 | 转基因拟南芥中产生8-异戊烯基黄酮类化合物 |
| 酿酒酵母 | 黄酮异戊烯化代谢 | SfN8DT-2 | SfN8DT-2 | 催化 | 与SfN8DT-1有93%氨基酸同一性，酶学性质相同 |
关键发现
- SfN8DT-1在酵母中表达获得naringenin 8-二甲基烯丙基转移酶活性，活性为1.38±0.3 nmol h^-1 mg protein^-1
- Km值分别为DMAPP 106 μM、naringenin 55 μM
- 底物特异性实验显示仅接受naringenin(100%)、liquiritigenin(102%)和hesperetin(52%)，对DMAPP有严格特异性
- 转基因拟南芥中检测到8-二甲基烯丙基山柰酚(8DK)含量为4.4±0.43 μg/g DW，补加100 μM naringenin后产生8DN(5.1±0.93 μg/g DW)、8DK(5.1±1.05 μg/g DW)、二甲基烯丙基芹菜素(DA,4.4±0.92 μg/g DW)和二甲基烯丙基槲皮素(DQ,2.7±0.65 μg/g DW)
- SfN8DT-1在苦参根皮中特异表达，受酵母提取物、茉莉酸甲酯和水杨酸诱导。
研究结论
SfN8DT-1是第一个在植物中鉴定的黄酮特异性异戊烯基转移酶，参与苦参酮G生物合成，可在异源植物中产生异戊烯基黄酮，为异戊烯基黄酮类活性成分的代谢工程生产提供了关键基因。