An Arabidopsis Purple Acid Phosphatase with Phytase Activity Increases Foliar Ascorbate
- 作者
- Wenyan Zhang, Hope A. Gruszewski, Boris I. Chevone, Craig L. Nessler
- 单位
- Department of Plant Pathology, Physiology and Weed Science, Virginia Polytechnic Institute and State University, Blacksburg, Virginia 24061
- 杂志
- Plant Physiology（2008）
- DOI
- 10.1104/pp.107.109934
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
植物细胞中抗坏血酸（AsA）水平的调控机制尚不清楚，尤其是抗坏血酸生物合成途径如何受到底物供应和关键酶活性的调节。
研究策略
利用激活标签突变体筛选获得高抗坏血酸表型株系，结合基因过表达和T-DNA插入突变体分析AtPAP15的功能；通过体外重组蛋白酶活测定、体内部分纯化酶活测定及代谢物含量分析，证实AtPAP15具有植酸酶活性并参与抗坏血酸合成调控。
核心内容
该研究通过激活标签突变体筛选，在拟南芥中鉴定到紫色酸性磷酸酶基因AtPAP15，并证实其具有植酸酶活性，参与叶片抗坏血酸（AsA）合成的调控。激活标签突变体AT23040叶片总AsA约为野生型的2倍，过表达AtPAP15的株系叶片AsA同样提高2倍，同时叶片植酸含量降低20%–30%；而T-DNA插入敲除突变体的叶片AsA降低约30%，植酸含量增加15%–20%。体外重组酶活性测定显示，GST:AtPAP15对植酸的比活力为711±112 nmol Pi min⁻¹ mg⁻¹，最适pH为4.5，证实其植酸酶功能。体内部分纯化酶分析进一步表明过表达株系对植酸的活性比野生型高约90%，而敲除株系低于野生型的20%。此外，过表达株系在150 mM NaCl下根长加倍，敲除株系在盐或ABA条件下根长仅为野生型的30%–75%。这些结果揭示AtPAP15通过水解植酸释放肌醇，增加抗坏血酸合成底物供应，从而提升AsA含量并增强植株对盐和渗透胁迫的耐受性。
创新点
首次鉴定拟南芥紫色酸性磷酸酶AtPAP15具有植酸酶活性，并揭示其通过水解植酸释放肌醇，增加抗坏血酸合成底物供应的新调控机制。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 拟南芥（Arabidopsis thaliana） | 抗坏血酸生物合成（肌醇途径） | AtPAP15 (At3g07130) | AtPAP15 | 催化 | 具有紫色酸性磷酸酶/植酸酶活性，水解植酸生成肌醇和游离磷酸，调节叶抗坏血酸水平 |
| 大肠杆菌（Escherichia coli BL21） | 重组蛋白表达 | AtPAP15 | GST:AtPAP15 | 催化 | 用于体外酶活测定，对植酸活性最高 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae INVSc1） | 重组蛋白表达 | AtPAP15 | AtPAP15:His-6 | 催化 | 用于体外酶活测定，具有糖基化可能 |
关键发现
- 激活标签突变体AT23040叶总AsA约为野生型的2倍
- Pro-35S:AtPAP15过表达株系叶AsA提高2倍，叶植酸降低20%-30%，根在150 mM NaCl条件下长度加倍，在1 μM ABA下根长比野生型增加>100%
- AtPAP15敲除突变体（S004877和S059899）叶AsA降低约30%，植酸增加15%-20%，盐/渗透胁迫和ABA条件下根长仅为野生型的30%-75%
- 重组GST:AtPAP15对植酸活性为711±112 nmol Pi min⁻¹ mg protein⁻¹，AtPAP15:His-6为751±107
- 对pNPP活性分别为546±40和308±26，对Ins(1)P1活性为207±32和200±71
- 最适pH为4.5
- 体内部分纯化酶显示过表达株系对pNPP、NaPP和植酸的活性分别比野生型高约70%、80%和90%，敲除株系植酸酶活性低于野生型的20%。
研究结论
AtPAP15是一种植酸酶，通过水解植酸产生肌醇和游离磷酸，增加肌醇供应从而促进拟南芥叶片抗坏血酸合成，并影响植株对盐、渗透胁迫及ABA的响应。