A Visual Reporter System for Virus-Induced Gene Silencing in Tomato Fruit Based on Anthocyanin Accumulation
- 作者
- Diego Orzaez, Aurora Medina, Sara Torre, Josefina Patricia Fernández-Moreno, José Luis Rambla, Asun Fernández-del-Carmen, Eugenio Butelli, Cathie Martin, Antonio Granell
- 单位
- Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Universidad Politécnica de Valencia, 46022 Valencia, Spain; John Innes Centre, Colney, Norwich NR4 7UH, United Kingdom
- 杂志
- Plant Physiology（2009）
- DOI
- 10.1104/pp.109.139006
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
番茄果实VIGS沉默效果分布不均，导致无法对非视觉表型进行定量分析
研究策略
利用花青素积累作为可视化报告系统：构建表达金鱼草转录因子Delila和Roseal1的转基因番茄系（Del/Ros1）使果实呈紫色，将目标基因片段与Delila/Roseal1片段串联在同一TRV载体中，通过共沉默实现沉默区域的可视追踪，并指导组织解剖和代谢组学分析。
核心内容
该研究开发了一套基于花青素积累的可视化报告系统，用于番茄果实病毒诱导基因沉默（VIGS）的效果追踪与功能解析。研究者构建了组成性表达金鱼草转录因子Delila和Roseal1的转基因番茄系（Del/Ros1），使果实呈紫色；将目标基因片段与Delila/Roseal1片段串联于同一TRV载体，通过共沉默使沉默区域紫色消失，实现沉默范围的可视化。结果显示，串联构建体可高效共沉默，沉默表面可达80%；以pds沉默为例，香叶醛和6-甲基-5-庚烯-2-酮显著降低（P<0.0005）。结合GC-MS与OPLS-DA代谢组学分析，该系统成功解析了TomloxC缺失导致己醛等C6醛下降而辛醛升高（P=0.0002），以及SIDO01沉默使苯甲醛增加约8倍等代谢变化。Del/Ros1本身使番茄红素衍生挥发物降低1.6至1.7倍，但通过比较沉默区与共沉默区可有效校正。该花青素监测的果实VIGS系统为番茄成熟过程中基因功能与代谢网络研究提供了快速可视化的高通量工具。
创新点
1. 开发了基于花青素积累的VIGS可视化报告系统；2. 证明串联构建体可实现高效共沉默；3. 将系统转移至大果型番茄便于组织分离；4. 结合GC-MS和OPLS-DA代谢组学分析，成功用于挥发性代谢物相关基因的功能解析。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 番茄（Solanum lycopersicum）MicroTom Del/Ros1转基因系 | 花青素生物合成途径 | Delila, Roseal1 | Delila, Roseal1 | 调控 | 利用E8启动子在果实中特异表达，作为可视化报告系统，沉默导致紫色表型丢失 |
| 番茄（Solanum lycopersicum）F6DR系（globe型） | 花青素生物合成途径 | Delila, Roseal1 | Delila, Roseal1 | 调控 | 由MT Del/Ros1与MoneyMaker杂交而来，果实沉默表面可达80%，便于组织解剖 |
| 番茄（Solanum lycopersicum）果实 | 类胡萝卜素生物合成途径 | PDS | 八氢番茄红素脱饱和酶 | 催化 | 沉默导致番茄红素积累减少，香叶醛和6-甲基-5-庚烯-2-酮等挥发物显著降低 |
| 番茄（Solanum lycopersicum）果实 | 脂肪酸衍生挥发物生物合成途径 | TomloxC | 脂氧合酶C | 催化 | 沉默导致C6和C5醛减少，辛醛和癸醛增加 |
| 番茄（Solanum lycopersicum）果实 | 苯丙烷/苯甲酸酯类挥发物生物合成途径 | SIDO01 | MYB转录因子ODORANT1同源蛋白 | 调控 | 沉默导致苯甲醛增加约8倍，水杨酸甲酯和愈创木酚减少 |
关键发现
在Del/Ros1果实中，沉默Del/Ros1导致紫色消失，出现红色区域。共递送独立载体不能共沉默，而串联构建体能使pds和Del/Ros1共沉默，果实只出现黄色（共沉默）和紫色（未沉默）区域。pds沉默使香叶醛和6-甲基-5-庚烯-2-酮显著降低（P<0.0005）。TomloxC沉默使己醛（P<0.0005）、E-2-己烯醛和Z-3-己烯醛等C6醛以及C5醛显著降低，而辛醛（P=0.0002）和癸醛（P=0.0007）显著升高。SIDO01沉默使苯甲醛增加约8倍，同时水杨酸甲酯和愈创木酚水平降低。F6DR果实的沉默表面可达80%。沉默区域（DR_S）的mRNA水平显著降低，花青素含量与Delila/Rosea1/pds mRNA水平负相关。Del/Ros1转基因本身使番茄红素衍生的挥发物降低1.6-1.7倍，但通过比较DR_S与DR/GOI_S可克服。
研究结论
本研究建立的花青素监测的果实VIGS（AMFV）系统能够高效、快速地对番茄果实成熟过程中的基因进行功能分析，尤其适用于代谢途径研究。通过可视化标记指导组织解剖，结合GC-MS代谢组学分析，成功解析了pds、TomloxC和SIDO01在挥发性有机物生成中的作用，为番茄果实代谢网络的高通量研究提供了有力工具。