Pleiotropic Modulation of Carbon and Nitrogen Metabolism in Arabidopsis Plants Overexpressing the NAD kinase2 Gene
- 作者
- Hideyuki Takahashi, Kentaro Takahara, Shin-nosuke Hashida, Takayuki Hirabayashi, Tamaki Fujimori, Maki Kawai-Yamada, Tomoyuki Yamaya, Shuichi Yanagisawa, Hirofumi Uchimiya
- 单位
- Iwate Biotechnology Research Center; Institute of Molecular and Cellular Biosciences, University of Tokyo; Biotechnology Sector, Environmental Science Research Laboratory, Central Research Institute of Electronic Power Industry; Department of Applied Biological Chemistry, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, University of Tokyo; Japan Science and Technology Agency, Core Research for Evolutional Science and Technology; Department of Environmental Science and Technology, Saitama University; Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University
- 杂志
- Plant Physiology（2009）
- DOI
- 10.1104/pp.109.140665
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析过表达叶绿体NAD激酶2（NADK2）提高NADP水平对拟南芥碳和氮同化代谢的影响，并验证辅因子工程作为改善植物代谢的策略。
研究策略
构建35S启动子驱动的NADK2过表达转基因拟南芥，利用CE-MS进行代谢物谱分析，测定卡尔文循环酶活性、氮同化相关酶活性及基因表达，并与nadk2突变体比较。
核心内容
该研究通过构建35S启动子驱动的NADK2过表达转基因拟南芥，系统解析了提高NADP水平对碳氮同化代谢的协同调控作用。代谢物谱分析显示，过表达株系NADK活性为野生型的2.1至2.8倍，NADP(H)/NAD(H)比值提高1.5至1.7倍，但总吡啶核苷酸含量和氧化还原状态未发生显著改变。在碳代谢方面，Rubisco初始活性由野生型的9.5 μmol min⁻¹ g⁻¹ FW升至10.5至11.2，卡尔文循环中间物如RuBP、核酮糖-5-磷酸等含量升高；在氮代谢方面，谷氨酰胺含量由野生型的4236.9 nmol g⁻¹ FW升至6490.2至6555.0，谷氨酸由2786.6升至3917.8至4388.1，总氨基酸含量亦显著增加。相比之下，nadk2突变体谷氨酰胺和谷氨酸含量降低，硝酸盐积累约为野生型10倍，且仅47个基因表达改变，远少于突变体的2878个。结果表明，仅通过提高NADP水平即可协同激活碳固定与氮同化，辅因子水平的遗传操作是改善植物碳氮代谢的有效策略。
创新点
首次证明通过单独过表达NADK2提高NADP水平（而非改变总吡啶核苷酸池或氧化还原状态）可协同激活碳固定与氮同化，提出辅因子水平是植物代谢调控的关键因素。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Arabidopsis thaliana | 烟酰胺核苷酸代谢 | NADK2 | NAD kinase2 (NADK2) | 催化 | 叶绿体定位的NAD激酶，催化NAD+磷酸化生成NADP+。过表达株系NADK活性为野生型2.1-2.8倍，nadk2突变体为野生型一半。 |
| Arabidopsis thaliana | 卡尔文循环 | — | Rubisco (ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase) | 催化 | 过表达株系初始活性10.5-11.2 μmol min^-1 g^-1 FW（野生型9.5），总活性15.7-17.5（野生型14.4）；nadk2突变体两者均降低。 |
| Arabidopsis thaliana | 卡尔文循环 | — | 磷酸甘油酸激酶 (PGK)、NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (NADP-GAPDH)、醛缩酶、果糖-1,6-二磷酸酶 (FBPase)、磷酸核酮糖激酶 (PRK) | 催化 | 这些卡尔文循环酶活性在过表达株系中无显著变化，但RuBP含量升高。 |
| Arabidopsis thaliana | 氮同化 (GS/GOGAT循环) | GLN1;1, GLN1;3, GLN1;5, GS2 | 谷氨酰胺合成酶 (GS) | 催化 | nadk2突变体中GLN1;1和GLN1;3表达降低，过表达株系无显著差异；总GS活性在野生型、nadk2和过表达株系中相似（野生型692.9 nmol Gln min^-1 g^-1 FW）。 |
| Arabidopsis thaliana | 氮同化 (GS/GOGAT循环) | GLU1, GLU2, GLT1 | 谷氨酸合酶 (GOGAT) | 催化 | GLT1表达与NADK活性呈正相关，但GLU1/GLU2无明显规律；GOGAT活性未直接测定。 |
| Arabidopsis thaliana | 氮同化 (谷氨酸代谢) | GDH1, GDH2 | 谷氨酸脱氢酶 (GDH) | 催化 | GDH1和GDH2表达随NADK活性变化，但总GDH活性无显著差异（野生型36.3 nmol Glu min^-1 g^-1 FW）。 |
| Arabidopsis thaliana | 硝酸盐还原 | NIA1, NIA2 | 硝酸还原酶 (NR) | 催化 | nadk2突变体中NIA1/NIA2表达分别升高4倍和2.5倍，过表达株系表达降低；但NR活性和活化状态在三种基因型间无显著差异（野生型总活性668.0 nmol nitrite h^-1 g^-1 FW）。 |
| Arabidopsis thaliana | 硝酸盐还原 | NIR | 亚硝酸还原酶 (NIR) | 催化 | nadk2突变体中NIR表达升高，过表达株系表达降低。 |
关键发现
- NADK2过表达株系（OX1和OX2）NADK活性为野生型的2.1-2.8倍
- NADP(H)/NAD(H)比值提高1.5-1.7倍（野生型0.41，nadk2为0.11），但总NAD+NADP含量和(NADH+NADPH)/(NAD+NADP)比值无明显变化。Rubisco初始活性在OX1和OX2分别为10.5和11.2 μmol min^-1 g^-1 FW（野生型9.5），总活性分别为15.7和17.5（野生型14.4）。卡尔文循环中间物如Glc-6-P、Rib-5-P、RuBP、2-羟戊二酸等含量升高。Gln浓度在OX1和OX2分别为6490.2和6555.0 nmol g^-1 FW（野生型4236.9），Glu分别为3917.8和4388.1（野生型2786.6），总氨基酸含量分别为29502.4和28124.8（野生型21027.8）。光照条件下OX2的Glu合成速率为1992 nmol g^-1 FW h^-1，野生型为551。nadk2突变体Gln和Glu显著降低，NO3^-积累约为野生型10倍。不同KNO3浓度实验中，OX1在10、30、60 mM KNO3下生长优于野生型，但60 mM时生长受抑。microarray显示nadk2中2878个基因表达改变，而OX2中仅47个。
研究结论
NADK2过表达通过提高NADP水平（或NADP/NAD比值）正调控拟南芥碳和氮同化，表现为Rubisco活性、卡尔文循环中间物及氨基酸（尤其Gln/Glu）含量增加，且不依赖总吡啶核苷酸库和氧化还原状态的改变。辅因子水平的遗传操作是改善植物碳氮同化的有效策略。