Transcriptional-Metabolic Networks in β-Carotene-Enriched Potato Tubers: The Long and Winding Road to the Golden Phenotype
- 作者
- Gianfranco Diretto, Salim Al-Babili, Raffaela Tavazza, Federico Scossa, Velia Papacchioli, Melania Migliore, Peter Beyer, Giovanni Giuliano
- 单位
- Italian National Agency for New Technologies, Energy, and Sustainable Development, Casaccia Research Center, Rome 00123, Italy; Center for Applied Biosciences, Faculty of Biology, Universitat Freiburg, 79104 Freiburg, Germany
- 杂志
- Plant Physiology（2011）
- DOI
- 10.1104/pp.110.159368
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
维生素A缺乏是许多国家的公共卫生问题，通过生物强化主要作物（小麦、水稻、玉米、马铃薯）的β-胡萝卜素含量有望缓解。本研究旨在系统解析不同CrtB、CrtI、CrtY转基因组合及启动子（35S和Patatin）对马铃薯块茎和叶片类胡萝卜素积累及内源基因转录的影响，阐明Golden表型形成的条件与调控机制。
研究策略
构建了六种不同启动子-基因组合的转基因马铃薯（pK-I、pK-BI、pK-YBI、pP-I、pP-BI、pP-YBI），每种组合筛选10个转基因系，选择表达子和非表达子各2个进行HPLC类胡萝卜素定量和实时RT-PCR转录分析；利用层次聚类、相关矩阵和网络相关分析（新开发方法）评估转录本和代谢物的关联，并通过'guilt-by-profiling'鉴定关键内源调控基因。
核心内容
该研究构建了六种不同启动子（组成型35S与块茎特异性Patatin）与细菌类胡萝卜素合成基因（CrtB、CrtI、CrtY）组合的转基因马铃薯，系统比较了各组合对块茎和叶片类胡萝卜素积累及内源基因转录的影响。通过HPLC定量与实时RT-PCR分析，结合层次聚类和网络相关分析，解析了Golden表型形成的分子条件。结果显示，仅在Patatin启动子驱动下三个基因协同高表达的pP-YBI组合才能产生Golden表型，其块茎总类胡萝卜素含量较野生型增加约20倍，橙色愈伤组织中β-胡萝卜素最高达787.3 μg/g干重，约为野生型的128.9倍。单独表达CrtI则干扰叶片类胡萝卜素代谢，使叶绿素和类胡萝卜素分别减少约25%和34%。网络分析进一步鉴定出PSY1、LUT1、NXS等内源基因作为负调控节点，并发现甲羟戊酸途径及生育酚、赤霉素相关基因的差异调控。该研究表明Golden表型依赖于细菌基因在块茎特异性启动子下的高水平协同表达及对内源转录的最小扰动，同时为优化块茎类胡萝卜素含量提供了新的内源操作靶点。
创新点
['系统比较六种CrtB/CrtI/CrtY组合及组成型35S与块茎特异性Patatin启动子的效应，明确了Golden表型需要三个基因在Pat启动子下协同高表达', '发现CrtI单独表达即足以干扰叶片类胡萝卜素生成，而块茎中β-胡萝卜素积累必须依赖CrtB和CrtY的参与', '开发了一种新的网络相关分析方法，并鉴定出PSY1、LUT1、NXS等内源基因作为负调控节点，为后续代谢工程提供新靶点']
研究对象（16）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Solanum tuberosum | 类胡萝卜素生物合成 | CrtB | 八氢番茄红素合成酶 | 催化 | 细菌来源（Erwinia），转基因，由Pat1启动子驱动 |
| Solanum tuberosum | 类胡萝卜素生物合成 | CrtI | 八氢番茄红素脱氢酶/异构酶 | 催化 | 细菌来源（Erwinia），转基因，由35S或Pat2启动子驱动 |
| Solanum tuberosum | 类胡萝卜素生物合成 | CrtY | 番茄红素β-环化酶 | 催化 | 细菌来源（Erwinia），转基因，由35S或Pat2启动子驱动 |
| Solanum tuberosum | 类胡萝卜素生物合成 | PSY1 | 八氢番茄红素合成酶1 | 催化 | 内源基因，在Golden块茎中下调，负调控节点 |
| Solanum tuberosum | 类胡萝卜素生物合成 | PSY2 | 八氢番茄红素合成酶2 | 催化 | 内源基因，与PSY1协同调控 |
| Solanum tuberosum | 类胡萝卜素生物合成 | PDS | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 内源基因，多数转基因块茎中上调 |
| Solanum tuberosum | 类胡萝卜素生物合成 | ZDS | ζ-胡萝卜素脱氢酶 | 催化 | 内源基因，参与脱氢步骤 |
| Solanum tuberosum | 类胡萝卜素生物合成 | CrtISO | 胡萝卜素异构酶 | 催化 | 内源基因，催化顺式-反式异构化 |
| Solanum tuberosum | 类胡萝卜素生物合成 | LCY-b | 番茄红素β-环化酶 | 催化 | 内源基因，在Golden块茎中上调，参与β-分支 |
| Solanum tuberosum | 类胡萝卜素生物合成 | LCY-e | 番茄红素ε-环化酶 | 催化 | 内源基因，在Golden块茎中上调，参与α-分支 |
| Solanum tuberosum | 类胡萝卜素生物合成 | CHY1 | 非血红素β-胡萝卜素羟化酶1 | 催化 | 内源基因，在BI和YBI系中普遍上调 |
| Solanum tuberosum | 类胡萝卜素生物合成 | CHY2 | 非血红素β-胡萝卜素羟化酶2 | 催化 | 内源基因，响应不均匀 |
| Solanum tuberosum | 类胡萝卜素生物合成 | LUT1 | P450胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 内源基因，在Golden块茎中显著下调，负调控节点 |
| Solanum tuberosum | 类胡萝卜素生物合成 | LUT5 | P450胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 内源基因，在BI系中强上调，参与两分支羟化 |
| Solanum tuberosum | 类胡萝卜素生物合成 | ZEP | 玉米黄质环氧化酶 | 催化 | 内源基因，催化玉米黄质转化为紫黄质 |
| Solanum tuberosum | 类胡萝卜素生物合成 | NXS | 新黄质合酶 | 催化 | 内源基因，在Golden块茎中下调，负调控节点，可能具有番茄红素β-环化酶活性 |
关键发现
- Golden（pP-YBI）块茎总类胡萝卜素含量较野生型增加约20倍，此前报道β-胡萝卜素最高达47 μg/g干重，为四大主粮中最高
- pP-YBI橙色愈伤组织中总类胡萝卜素最高达1090.1 μg/g干重（pP-YBI 30），β-胡萝卜素达787.3 μg/g干重，约为野生型的128.9倍，占总类胡萝卜素的约75%
- 叶片中表达CrtI（pK系列）导致叶绿素和类胡萝卜素分别减少约25%和34%，且所有类胡萝卜素类别（α-叶黄素、β-叶黄素、β-胡萝卜素）均下降
- pP-YBI块茎中三个转基因表达量较pK-YBI高10-100倍，且对内源转录本的扰动较小，形成'golden ratio'
- 网络分析显示CrtB、CrtI、CrtY为Golden块茎正调控节点，PSY1、LUT1、NXS为负调控节点；微阵列分析显示甲羟戊酸途径、生育酚和赤霉素途径的基因也发生差异调控。
研究结论
Golden表型的形成依赖于CrtB、CrtI、CrtY三个基因在块茎特异性Patatin启动子下的高水平协同表达，同时内源类胡萝卜素基因转录扰动最小。CrtI表达干扰叶片类胡萝卜素代谢，而块茎中β-胡萝卜素积累需要所有三个细菌基因。通过相关性分析鉴定出PSY1、LCY-e、CHY、LUT1、LUT5等内源基因是进一步优化块茎类胡萝卜素含量的潜在操作靶点，尤其LUT1和LUT5是新的候选基因。