A Bifunctional Geranyl and Geranylgeranyl Diphosphate Synthase Is Involved in Terpene Oleoresin Formation in Picea abies
- 作者
- Axel Schmidt, Betty Wachtler, Ulrike Temp, Trygve Krekling, Armand Séguin, Jonathan Gershenzon
- 单位
- Max Planck Institute for Chemical Ecology, Department of Biochemistry, Beutenberg Campus, D-07745 Jena, Germany; Department of Plant and Environmental Sciences, Norwegian University of Life Sciences, N-1432 Ås, Norway; Natural Resources Canada, Canadian Forest Service, Laurentian Forestry Centre, Quebec, Quebec, Canada G1V 4C7
- 杂志
- Plant Physiology（2009）
- DOI
- 10.1104/pp.109.144691
- 所属领域
- 植物代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析挪威云杉（Picea abies）中参与萜烯树脂形成的双功能短链异戊烯基二磷酸合酶（PaIDS1），该酶能同时产生香叶基二磷酸（GPP, C10）和香叶基香叶基二磷酸（GGPP, C20），并研究其在诱导防御反应中的作用。
研究策略
通过同源PCR克隆PaIDS1基因，在大肠杆菌和云杉胚性组织中异源表达验证酶活性；用甲基茉莉酸处理分析转录诱导模式；通过免疫金标记定位蛋白在创伤树脂道上皮细胞；利用定点突变和嵌合体解析决定产物特异性的关键氨基酸。
核心内容
本研究从挪威云杉中克隆并鉴定了一个双功能短链异戊烯基二磷酸合酶基因PaIDS1。通过在大肠杆菌和云杉胚性组织中异源表达，证实重组PaIDS1蛋白能同时催化生成香叶基二磷酸（GPP, C10）和香叶基香叶基二磷酸（GGPP, C20），产物比例约为9:1，对DMAPP和IPP的K_m分别为390 μM和170 μM。甲基茉莉酸处理显著诱导该基因表达，树皮中转录本在第8天达峰值，增加约350倍。免疫金标记将其定位于创伤树脂道上皮细胞，且转录本在木部最高。定点突变和嵌合体实验表明，少数关键氨基酸残基即可显著改变产物特异性：如M175I突变使GGPP比例降至2%，而L180F+P174C双突变使GGPP比例增至35%。该研究首次报道一个同源二聚体短链异戊烯基二磷酸合酶可同时产生相差两个C5单元的C10和C20产物，为挪威云杉萜烯树脂中单萜和二萜的合成共同提供前体，并提示此类双功能酶可能由单产物酶经简单突变进化而来。
创新点
首次报道一个同源二聚体短链异戊烯基二磷酸合酶同时产生C10和C20两个产物（相差两个C5单元），且产物比例受少数氨基酸残基控制；通过转基因云杉胚性组织确认该酶在真核系统中的双重活性。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 萜类生物合成（异戊二烯代谢） | PaIDS1 | PaIDS1（双功能GPP/GGPP合酶） | 催化 | 异源表达并纯化重组蛋白，确认GPP和GGPP合酶活性，产物比约9:1 |
| Picea abies embryogenic tissue（云杉胚性组织） | 萜类生物合成 | PaIDS1 | PaIDS1 | 催化 | 农杆菌介导转化过表达PaIDS1，验证真核系统中双功能活性，转录本较对照高约3000倍 |
| Picea abies（挪威云杉） | 萜烯树脂生物合成（单萜和二萜） | PaIDS1 | PaIDS1 | 催化 | 转录本主要存在于木部和树皮，MJ处理后显著诱导，蛋白定位于创伤树脂道上皮细胞 |
| Picea abies | 萜类生物合成 | PaIDS2 | PaIDS2（GPP合酶） | 催化 | 用于序列比较和构建嵌合体，作为单产物GPP合酶对照 |
| Picea abies | 萜类生物合成 | PaIDS5 | PaIDS5（GGPP合酶） | 催化 | 用于序列比较和构建嵌合体，作为单产物GGPP合酶对照 |
| Picea abies | 萜类生物合成 | PaIDS4 | PaIDS4（FPP合酶） | 催化 | 作为免疫组织化学阴性对照，不参与诱导树脂形成 |
关键发现
- 重组PaIDS1蛋白同时具有GPP和GGPP合酶活性，GPP:GGPP产物比约9:1
- 对DMAPP的K_m为390 μM，对IPP的K_m为170 μM，V_max为4.2 nkat mg^-1，k_cat为1.4 s^-1
- MJ处理诱导后树皮中PaIDS1转录本在第8天达峰值，增加约350倍，木材中第2天达峰值约14倍
- 转基因胚性组织中PaIDS1转录本比对照高约3000倍
- PaIDS1转录本在木部最高，树皮约为木部20%，针叶中未检出
- 定点突变M175I使产物变为95% GPP、3% FPP、2% GGPP，P174C+M175I双突变产生100% GPP，M165Y产生90% GPP和10% FPP，I235T和L273F均产生100% GPP，L180F+P174C双突变使GGPP比例增至35%。
研究结论
PaIDS1是一种双功能的GPP/GGPP合酶，定位于创伤树脂道上皮细胞，受MJ强烈诱导，为挪威云杉萜烯树脂中单萜和二萜的合成共同提供前体。其产物比例可通过少数氨基酸残基改变，可能由单产物酶经简单突变进化而来。