Evolution of Diterpene Metabolism: Sitka Spruce CYP720B4 Catalyzes Multiple Oxidations in Resin Acid Biosynthesis of Conifer Defense against Insects
- 作者
- Björn Hamberger, Toshiyuki Ohnishi, Britta Hamberger, Armand Séguin, Jörg Bohlmann
- 单位
- Michael Smith Laboratories, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Canada; Canadian Forest Service, Laurentian Forestry Centre, Quebec City, Quebec, Canada; Department of Plant Biology and Biotechnology, University of Copenhagen, Denmark; Division of Global Research Leaders, Shizuoka University, Japan
- 杂志
- Plant Physiology（2011）
- DOI
- 10.1104/pp.111.185843
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析针叶树中二萜树脂酸（DRA）这一特化代谢的分子多样性及其进化机制，特别是CYP720B家族P450酶在树脂酸生物合成中的生化功能，并比较特化代谢与一般代谢（赤霉素生物合成）的进化关系。
研究策略
通过转录组挖掘获得云杉和松树中39个CYP720B成员，克隆了12个北美云杉（Picea sitchensis）CYP720B全长cDNA；利用表达谱、茉莉酸甲酯诱导及激光显微切割定位筛选候选基因；在工程酵母和E. coli中异源表达PsCYP720B4，进行体内/体外酶活测定和动力学分析；通过白杨RNAi干扰验证植物体内功能；结合系统发育和基因结构比较分析进化关系。
核心内容
该研究解析了针叶树二萜树脂酸（DRA）生物合成关键酶CYP720B4的生化功能与进化机制。作者从北美云杉和松树转录组中发掘39个CYP720B家族成员，克隆12个北美云杉全长cDNA，通过表达谱、茉莉酸甲酯诱导及激光显微切割筛选候选基因，随后在工程酵母和大肠杆菌中异源表达PsCYP720B4进行酶活测定与动力学分析，并以白杨RNAi验证其体内功能。结果表明，PsCYP720B4是多底物多功能P450酶，可氧化24种二萜底物并催化C-18位连续三步氧化，在酵母中合成异海松酸最高达0.9 mg/L、枞酸最高0.2 mg/L；对脱氢枞二烯醇的催化效率为1.05 min⁻¹ μM⁻¹。RNAi干扰后白杨中脱氢枞酸降低30%–50%，异海松酸和海松酸降低35%–65%。系统发育分析显示CYP720B4与赤霉素代谢中的CYP701趋同进化，而特化代谢的底物多样化程度远高于保守的一般代谢，该发现为理解针叶树防御性次生代谢的分子演化提供了关键证据。
创新点
首次对CYP720B家族成员PsCYP720B4进行全面的功能表征，证明其是多底物、多功能P450酶，可催化24种二萜底物的连续C-18氧化；揭示了CYP720B4与赤霉素代谢中的CYP701在功能上趋同进化；首次在针叶树中利用RNAi验证了CYP720B基因在DRA生物合成中的功能。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae (WAT11, 含AtCPR) | 二萜树脂酸生物合成 | ScGGPPS | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 工程酵母中提供GGPP前体，用于生产二萜烯烃 |
| Saccharomyces cerevisiae | 二萜树脂酸生物合成 | PaLAS | 左旋海松二烯/枞二烯合酶 | 催化 | 催化GGPP生成abietadiene，在酵母中产量最高6 mg/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 二萜树脂酸生物合成 | PaISO | 异海松二烯合酶 | 催化 | 催化GGPP生成isopimaradiene，在酵母中产量最高1.6 mg/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 二萜树脂酸生物合成 | PsCYP720B4 | 细胞色素P450 CYP720B4 | 催化 | 多底物多功能酶，催化C-18连续三步氧化；异海松酸最高0.9 mg/L，枞酸最高0.2 mg/L |
| Escherichia coli | 二萜树脂酸生物合成 | PsCYP720B4 | 细胞色素P450 CYP720B4 (N端修饰) | 催化 | 在E. coli膜组分中表达，用于体外酶活与动力学测定 |
| Picea glauca (白云杉) | 二萜树脂酸生物合成 | PgCYP720B4 | CYP720B4 | 催化 | RNAi干扰使转录水平降至25%（最低5.9%），导致脱氢枞酸降低30%-50%，异海松酸和海松酸降低35%-65% |
| Picea sitchensis (北美云杉) | 二萜树脂酸生物合成 | PsLAS | 左旋海松二烯/枞二烯合酶 | 催化 | 在皮层树脂道上皮细胞高表达，与CYP720B4共定位 |
| Saccharomyces cerevisiae | 二萜树脂酸生物合成 | AtCPR (ATR1) | NADPH-细胞色素P450还原酶 | 能量供给 | 为CYP720B4催化的氧化反应提供还原力，整合于WAT11基因组 |
| Escherichia coli | 二萜树脂酸生物合成 | PsCPR | 北美云杉NADPH-细胞色素P450还原酶 | 能量供给 | 体外实验与PsCYP720B4共同重组，用于酶活和动力学测定 |
关键发现
- 在北美云杉茎组织中鉴定到28种二萜类化合物，外茎组织总二萜含量为48.98±4.30 μg/mg干重，其中92%为树脂酸，5%为醛，3%为醇，<1%为烯烃
- 内茎组织仅为0.54±0.11 μg/mg干重。克隆了12个北美云杉CYP720B全长cDNA，共发现39个CYP720B成员构成4个进化支。PsCYP720B4在工程酵母中催化异海松二烯生成异海松酸（最高0.9 mg/L），催化枞二烯生成枞酸（最高0.2 mg/L）
- 酵母产生枞二烯产量最高6 mg/L，异海松二烯最高1.6 mg/L。PsCYP720B4可氧化24种不同二萜底物，对脱氢枞二烯醇的催化效率（kcat/Km）为1.05 min⁻¹ μM⁻¹，分别是脱氢枞二烯和脱氢枞二烯醛的1.5倍和3倍
- 对异海松二烯醛和异海松二烯醇的kcat/Km分别为0.77和0.60。RNAi干扰白杨CYP720B4后，脱氢枞酸降低30%-50%，异海松酸和海松酸降低35%-65%。PsCYP720B4与火炬松PtCYP720B1氨基酸一致性为86%。
研究结论
PsCYP720B4是DRA生物合成中的关键多底物、多功能P450酶，催化二萜C-18位连续三步氧化形成树脂酸，其底物谱和动力学特征支持其在脱氢枞酸形成中的优势作用；CYP720B与CYP701在特化代谢与一般代谢中趋同进化，特化代谢的多样化程度远高于保守的一般代谢。