The Transcription Factor CrWRKY1 Positively Regulates the Terpenoid Indole Alkaloid Biosynthesis in Catharanthus roseus
- 作者
- Nitima Suttipanta, Sitakanta Pattanaik, Manish Kulshrestha, Barunava Patra, Sanjay K. Singh, Ling Yuan
- 单位
- Department of Plant and Soil Sciences, University of Kentucky, Lexington, Kentucky 40546; Kentucky Tobacco Research and Development Center, Lexington, Kentucky 40546; Naprogenix, Inc., Lexington, Kentucky 40502
- 杂志
- Plant Physiology（2011）
- DOI
- 10.1104/pp.111.181834
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
长春花萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成的转录调控网络尚不清楚，尤其是WRKY转录因子在该途径中的功能未见报道。
研究策略
从长春花中克隆WRKY转录因子CrWRKY1，通过农杆菌介导的毛状根转化获得CrWRKY1过表达和SRDX显性抑制（CrWRKY1-SRDX）株系，结合qPCR、EMSA、酵母单杂交、原生质体瞬时表达、酶活测定及HPLC/LC-MS/MS代谢物分析，系统研究CrWRKY1对TIA途径的调控作用。
核心内容
该研究首次在长春花中功能鉴定了WRKY转录因子CrWRKY1，系统揭示了其调控萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成的分子机制。作者通过农杆菌介导的毛状根转化获得CrWRKY1过表达和SRDX显性抑制株系，结合EMSA、酵母单杂交、qPCR及HPLC/LC-MS/MS等手段进行分析。结果显示CrWRKY1可直接结合TDC启动子W盒元件并激活其表达，过表达株系中TDC转录水平上调7–9倍，酶活从21.6提升至37.7 pmol s⁻¹ mg⁻¹，色胺含量增加150%至76.0 μg/g干重。与此同时，转录激活因子ORCA2、ORCA3和CrMYC2分别被抑制约90%、80%和60%，而蛇根碱含量从131.5升至291.5 μg/g干重（最高3倍），阿吗碱略有增加，长春质碱和它波宁则下降。SRDX抑制株系中TDC表达下降83%，蛇根碱与对照相当但长春质碱和它波宁升高。该研究揭示了CrWRKY1通过直接激活TDC并抑制ORCA3等因子、促进蛇根碱分支积累的调控网络，为转录因子工程改造TIA代谢途径提供了新靶点。
创新点
['首次功能鉴定长春花WRKY转录因子CrWRKY1', '证明CrWRKY1直接结合TDC启动子W盒元件并激活TDC表达', '揭示CrWRKY1通过抑制ORCA3等激活因子、促进蛇根碱分支积累的调控机制']
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 长春花（Catharanthus roseus）毛状根 | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成 | CrWRKY1 | CrWRKY1 | 调控 | III组WRKY转录因子，根中优先表达，受MJ/GA/乙烯诱导，直接结合TDC启动子W盒 |
| 长春花毛状根 | TIA生物合成（吲哚途径） | TDC | 色氨酸脱羧酶 | 催化 | 将色氨酸转化为色胺，是CrWRKY1的直接靶基因，其表达受CrWRKY1正调控 |
| 长春花毛状根 | TIA生物合成调控网络 | ORCA3 | ORCA3 | 调控 | AP2类转录激活因子，受CrWRKY1抑制表达（过表达时下调80%） |
| 长春花毛状根 | TIA生物合成调控网络 | ORCA2 | ORCA2 | 调控 | AP2类转录激活因子，受CrWRKY1抑制（过表达时下调90%） |
| 长春花毛状根 | TIA生物合成调控网络 | CrMYC2 | CrMYC2 | 调控 | bHLH转录因子，受CrWRKY1抑制（过表达时下调60%） |
| 长春花毛状根 | TIA生物合成调控网络 | ZCT1 | ZCT1 | 调控 | 锌指转录抑制因子，受CrWRKY1上调（过表达时增加1.4倍） |
关键发现
- ['CrWRKY1在根中表达量最高，约为果实的2.5倍
- 受茉莉酸甲酯（MJ）、赤霉素（GA）和乙烯诱导，MJ处理30 min表达升高约5倍，GA处理30 min升高4倍以上。', 'CrWRKY1过表达毛状根中TDC表达上调7-9倍，AS上调1.2倍，DXS上调0.7倍，SLS上调2.3倍，SGD上调2.4倍
- 转录激活因子ORCA2、ORCA3、CrMYC2分别被抑制约90%、80%、60%
- 转录抑制因子ZCT1、ZCT2、ZCT3分别上调1.4、0.3、3.2倍。', 'CrWRKY1-SRDX毛状根中TDC表达下降83%，AS下降47%，DXS下降88%
- ORCA3和CrMYC2分别上调4倍和3倍，ZCT1、ZCT2、ZCT3分别下降71%、33%、72%。', 'CrWRKY1过表达毛状根TDC酶活性从对照的21.6±3.8增加到37.7±2.2 pmol s⁻¹ mg⁻¹（增加73%），色胺含量从30.1±2.3升高到76.0±9.9 μg g⁻¹干重（增加150%）。', 'CrWRKY1毛状根蛇根碱含量为291.5±73.2 μg g⁻¹干重，显著高于对照131.5±23.7 μg g⁻¹（最高3倍）
- 阿吗碱含量从12.8±1.4升高到15.4±1.6 μg g⁻¹
- 而长春质碱和它波宁分别从87.5±6.5和11.2±3.0降至45.5±5.1和9.0±3.0 μg g⁻¹。', 'CrWRKY1-SRDX毛状根蛇根碱和阿吗碱水平与对照相当，但长春质碱和它波宁分别升高至100.2±15.1和19.3±1.6 μg g⁻¹。']
研究结论
CrWRKY1是首次被功能鉴定的长春花WRKY转录因子，通过直接结合TDC启动子W盒激活TDC表达，同时抑制ORCA3等转录激活因子，从而促进蛇根碱在根中的特异性积累。该研究为通过转录因子工程改造TIA代谢途径提供了新靶点。