The Promoter for Tomato 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme A Reductase Gene 2 Has Unusual Regulatory Elements That Direct High-Level Expression
- 作者
- Nikolai Dmitri Daraselia, Svetlana Tarchevskaya, Jonathon Orin Narita
- 单位
- University of Illinois at Chicago, Laboratory for Molecular Biology
- 杂志
- Plant Physiology（1996）
- DOI
- 10.1104/pp.112.2.727
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析番茄HMG2基因启动子中控制高水平表达的调控元件及其作用机制
研究策略
采用粒子轰击瞬时表达系统，构建HMG2启动子与萤火虫荧光素酶（Luc）融合的翻译和转录报告载体，通过5'缺失、替换突变和体外翻译实验，定位高水平表达所需的启动子区域。
核心内容
该研究解析了番茄HMG2基因启动子中控制高水平表达的新型调控元件。通过粒子轰击瞬时表达系统，将HMG2启动子与萤火虫荧光素酶基因融合，结合5′缺失、替换突变及体外翻译实验，定位了驱动强表达的关键区域。结果显示，含-58至+129区域（涵盖TATA、5′非翻译区和翻译起始区）的HMG2-Luc翻译融合活性与35S启动子相当；删除5′UTR后表达降至7%，替换为无关序列后为13%。进一步发现，HMG2翻译起始区融合到Luc基因可在35S启动子驱动下将表达提高约3倍，在小麦胚芽体外翻译系统中使mRNA翻译效率提高10倍，该区域ATG周围序列可形成自由能分别为-9.1和-9.5 kcal/mol的两个发夹结构。成熟番茄果实中HMG2 mRNA与番茄红素合成同步高水平积累。该启动子的强表达不依赖TATA上游序列，而由TATA下游的正调控元件通过转录与翻译双重机制协同驱动，代表了一类新型强植物启动子。
创新点
发现HMG2启动子的高水平表达不依赖TATA上游序列，而是由TATA下游的5'非翻译区（富含嘧啶的CT序列）和翻译起始区（可形成替代发夹结构）中的正调控元件控制；首次报道植物HMGR基因启动子的这种新颖调控方式。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 番茄果实（Lycopersicon esculentum cv VFNT） | 甲羟戊酸/异戊二烯生物合成 | HMG2 | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR） | 催化 | HMG2在成熟果实中高表达，其启动子为本研究分析对象 |
| 番茄果实（Lycopersicon esculentum cv VFNT） | 甲羟戊酸/异戊二烯生物合成 | HMG1 | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR） | 催化 | HMG1在幼果中高表达，与HMG2差异表达 |
| 番茄果实（Lycopersicon esculentum cv VFNT） | 甲羟戊酸/异戊二烯生物合成 | HMG3 | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR） | 催化 | HMG3表达水平较低，启动子序列与HMG1/2有差异 |
| 无（体外翻译系统：小麦胚芽/兔网织红细胞） | 报告基因 | Luc（firefly luciferase） | 萤火虫荧光素酶 | 催化 | 作为报告基因用于评估启动子和翻译起始区活性 |
关键发现
- HMG2 mRNA在成熟番茄果实中高水平积累，与番茄红素合成同步
- HMG1 mRNA仅在幼果中高表达。在粒子轰击瞬时表达系统中，含-58至+129区域（含TATA、5'UTR和翻译起始区）的HMG2-Luc翻译融合活性与35S启动子相当
- 删除5'UTR后表达降至7%，替换为无关序列后为13%。将HMG2翻译起始区融合到Luc基因，在35S启动子驱动下表达提高约3倍
- 在小麦胚芽体外翻译系统中，含HMG2起始区的mRNA翻译效率提高10倍，但兔网织红细胞裂解物中无差异。ATG周围序列可能形成两个发夹结构，自由能分别为-9.1和-9.5 kcal/mol。转录融合比翻译融合活性低3-4倍
- 无TATA的构建体活性低于1%。
研究结论
番茄HMG2启动子代表一类新型强植物启动子，其高水平表达依赖于TATA下游的5'UTR和翻译起始区中的正调控元件，这些元件通过转录和翻译双重机制增强表达。