Manoyl Oxide (13R), the Biosynthetic Precursor of Forskolin, Is Synthesized in Specialized Root Cork Cells in Coleus forskohlii
- 作者
- Irini Pateraki, Johan Andersen-Ranberg, Britta Hamberger, Allison Maree Heskes, Helle Juel Martens, Philipp Zerbe, Soren Spanner Bach, Birger Lindberg Moller, Jörg Bohlmann, Björn Hamberger
- 单位
- 丹麦哥本哈根大学植物与环境科学系；丹麦哥本哈根大学生物合成中心（bioSYNergy）；澳大利亚墨尔本大学植物学院；加拿大不列颠哥伦比亚大学Michael Smith实验室
- 杂志
- Plant Physiology（2014）
- DOI
- 10.1104/pp.113.228429
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
毛喉鞘蕊花（Coleus forskohlii）中毛喉素（forskolin）生物合成早期步骤的酶学和细胞学基础尚不清楚，特别是负责(13R)-manoyl oxide（forskolin的母核前体）形成的二萜合酶及其在根中的具体定位未被阐明。
研究策略
利用根转录组数据发掘CfTPS二萜合酶候选基因，通过大肠杆菌异源表达和本氏烟草瞬时表达进行体外/体内功能表征；结合根木栓层油体分离、组织化学染色（Nile Red）以及LC-MS/GC-MS代谢物分析，确定产物积累位置。
核心内容
该研究以毛喉鞘蕊花为对象，探究毛喉素生物合成早期步骤的酶学与细胞学基础。通过根转录组数据发掘二萜合酶候选基因，在大肠杆菌异源表达和本氏烟草瞬时表达中表征其功能，并利用根木栓层油体分离、Nile Red染色及LC-MS/GC-MS分析确定产物积累位置。结果鉴定出CfTPS2（copal-8-ol二磷酸合酶）与CfTPS3（class I二萜合酶）组合可立体特异性合成(13R)-manoyl oxide，而CfTPS1与CfTPS3/CfTPS4合成miltiradiene；CfTPS14被推测为ent-kaurene合酶参与赤霉素合成。组织表达分析显示CfTPS1、CfTPS2和CfTPS3在根木栓中的转录水平比其他组织高约1000倍，且分离油体中同时检出毛喉素及其前体(13R)-manoyl oxide，证实二者在根木栓层特殊细胞油体中共同积累。该工作首次阐明毛喉素母核前体合成的关键酶及其亚细胞定位，为完整途径解析和异源生产奠定基础。
创新点
首次发现毛喉素及其前体(13R)-manoyl oxide在根木栓层特殊细胞的油体中积累；鉴定出CfTPS2（copal-8-ol diphosphate合酶）与CfTPS3（class I diTPS）组合可立体特异性合成(13R)-manoyl oxide；通过系统发育和表达谱分析揭示了CfTPS家族在一般代谢与专一代谢中的功能分化。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌 (Escherichia coli) | 二萜生物合成 | CfTPS1 | CfTPS1 (class II 二萜合酶) | 催化 | 体外表达，产物为copalyl diphosphate |
| 大肠杆菌 (Escherichia coli) | 二萜生物合成 | CfTPS2 | CfTPS2 (class II 二萜合酶) | 催化 | 体外表达，产物为copal-8-ol diphosphate |
| 大肠杆菌 (Escherichia coli) | 二萜生物合成 | CfTPS3 | CfTPS3 (class I 二萜合酶) | 催化 | 体外表达，与CfTPS2联合生成(13R)-manoyl oxide |
| 大肠杆菌 (Escherichia coli) | 二萜生物合成 | CfTPS4 | CfTPS4 (class I 二萜合酶) | 催化 | 体外表达，与CfTPS1联合生成miltiradiene |
| 大肠杆菌 (Escherichia coli) | 赤霉素生物合成 | CfTPS14 | CfTPS14 (class I 二萜合酶) | 催化 | 推测为ent-kaurene合酶，参与一般代谢；体外活性较低 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 二萜生物合成 | CfTPS2 和 CfTPS3 | CfTPS2 + CfTPS3 | 催化 | 瞬时共表达，立体特异性生成(13R)-manoyl oxide |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 二萜生物合成 | CfTPS1 与 CfTPS3 或 CfTPS4 | CfTPS1 + CfTPS3/CfTPS4 | 催化 | 瞬时共表达，生成miltiradiene及少量dehydroabietadiene和abietadiene |
关键发现
- 根木栓层细胞含有独特的油体结构，Nile Red染色显示中性脂和极性脂非均匀分布，且分离的油体中检出forskolin和(13R)-manoyl oxide
- CfTPS1、CfTPS2和CfTPS3在根木栓中的转录水平比其他组织高1000倍
- 体外酶活和本氏烟草瞬时表达均证明CfTPS2+CfTPS3立体特异性合成(13R)-manoyl oxide，CfTPS1+CfTPS3/CfTPS4合成miltiradiene
- CfTPS14被推测为参与赤霉素生物合成的ent-kaurene合酶。
研究结论
本研究揭示了毛喉鞘蕊花中参与毛喉素生物合成早期步骤的关键二萜合酶（CfTPS2和CfTPS3），并证明了(13R)-manoyl oxide与毛喉素在根木栓层特殊细胞的油体中共同积累，为后续完整毛喉素途径的解析和异源生产奠定了基础。