Gene Discovery of Modular Diterpene Metabolism in Nonmodel Systems
- 作者
- Philipp Zerbe, Björn Hamberger, Macaire M.S. Yuen, Angela Chiang, Harpreet K. Sandhu, Lina L. Madilao, Anh Nguyen, Britta Hamberger, Soren Spanner Bach, Jörg Bohlmann
- 单位
- Michael Smith Laboratories, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Canada V6T 1Z4; Department of Plant Biology and Biotechnology, University of Copenhagen, Thorvaldsenvej 40, 1781 Copenhagen, Denmark
- 杂志
- Plant Physiology（2013）
- DOI
- 10.1104/pp.113.218347
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
植物二萜特殊代谢产物种类繁多、分布具有物种特异性，但缺乏单一参考系统来指导非模式植物中二萜生物合成基因的发现和快速功能注释；同时二萜合酶和P450等基因家族功能分化大，难以仅凭序列相似性预测功能。
研究策略
选取10种产二萜的非模式植物，利用代谢物谱确定转录组测序组织；结合454和Illumina测序进行de novo组装；构建定制二萜合酶和P450参考数据库挖掘候选基因；通过系统发育分析识别谱系特异性基因扩展；利用体外（微生物表达）和体内（本氏烟草瞬时表达）实验对代表性二萜合酶进行单基因及组合功能表征。
核心内容
针对非模式植物二萜代谢基因难以通过序列相似性直接注释的问题，该研究建立了一套整合代谢物靶向转录组、定制参考数据库、系统发育分析与体内外功能验证的模块化基因发现策略。对10个科属来源的二萜产植物，利用454和Illumina测序分别获得约550万和15亿条高质量读长，组装出近百万个转录本，并从中鉴定出46个二萜合酶候选基因及超过400个萜类相关P450候选基因，其中约59%的二萜合酶候选为全长序列。系统发育分析揭示了多个谱系特异性基因扩展事件，据此指导功能表征：在微生物和本氏烟草中验证了PxaTPS4为LAS型合酶，GrTPS6与GrTPS1偶联产生manoyl oxide，EpTPS3产生casbene，以及EpTPS7与EpTPS1或CfTPS14组合生成ent-kaurene。该工作提供了一套可复用的非模式植物二萜基因挖掘流程，并为合成生物学提供了多个跨物种可组合的酶模块，拓展了利用植物特殊代谢多样性进行异源生产的能力。
创新点
['开发了面向非模式系统的模块化二萜代谢基因发现通用策略，整合代谢组、转录组、定制参考数据库和系统发育分析', '揭示了二萜合酶家族中多个谱系特异性基因扩展（blooms），并利用系统发育信息指导功能注释', '通过单酶及组合酶体内外实验验证了新功能，包括manoyl oxide合酶、casbene合酶、ent-kaurene合酶等', '展示了利用跨物种二萜合酶组合产生非天然二萜产物的合成生物学潜力']
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | GGPP代谢/二萜合酶 | PxaTPS4 | levopimaradiene/abietadiene synthase (LAS) | 催化 | 体外表达，催化GGPP生成13-羟基-8(14)-abietene差向异构体，脱水后形成abietadiene、palustradiene、levopimaradiene和neoabietadiene混合物 |
| Escherichia coli | GGPP代谢/二萜合酶 | GrTPS5 | geranyllinalool synthase (GLS) | 催化 | 体外表达，催化GGPP生成geranyllinalool |
| Escherichia coli | GGPP代谢/二萜合酶 | GrTPS1 | labda-13-en-8-ol diphosphate synthase (LPPS) | 催化 | 体外表达，产生LPP及少量manoyl oxide和epi-manoyl oxide副产物 |
| Escherichia coli | GGPP代谢/二萜合酶 | GrTPS6 | manoyl oxide synthase (class I diTPS) | 催化 | 单独无活性，与GrTPS1偶联产生manoyl oxide；与玉米ent-CPS或PaLAS突变体偶联产生pimaradiene/abietadiene型产物 |
| Nicotiana benthamiana | GGPP代谢/二萜合酶 | EpTPS3 | casbene synthase (CBS) | 催化 | 体内瞬时表达产生casbene |
| Nicotiana benthamiana | 赤霉素（GA）生物合成 | EpTPS7 | ent-copalyl diphosphate synthase (ent-CPS) | 催化 | 与EpTPS1或CfTPS14共表达产生ent-kaurene |
| Nicotiana benthamiana | 赤霉素（GA）生物合成 | EpTPS1 | ent-kaurene synthase (ent-KS) | 催化 | 与EpTPS7共表达产生ent-kaurene |
| Nicotiana benthamiana | 赤霉素（GA）生物合成 | CfTPS14 | ent-kaurene synthase (ent-KS) | 催化 | 与EpTPS7共表达产生ent-kaurene |
| Saccharomyces cerevisiae | 二萜生物合成 | — | — | 催化 | 文中作为异源表达平台，用于二萜合酶和P450的代谢工程 |
关键发现
- 从10个物种（涉及5个科）中鉴定出46个新二萜合酶候选基因和超过400个推定与萜类相关的P450候选基因，资源包含近100万个预测转录本
- 454测序共获得约5,500,000条高质量读长（平均每物种610,377条），Illumina获得约1,500,000,000条高质量读长
- 454组装产生188,270个isogroups，Illumina组装产生1,164,906个contigs（712,222个components）
- 平均92%的CEGMA序列在454组装中存在，99%在Illumina组装中存在
- 59%的二萜合酶候选和44%的P450候选为全长序列。功能验证：PxaTPS4为LAS型二萜合酶（产物为13-羟基-8(14)-abietene差向异构体及脱氢产物混合物）
- GrTPS5为geranyllinalool合酶
- GrTPS1为LPP合酶
- GrTPS6与GrTPS1偶联产生manoyl oxide，与玉米ent-CPS偶联产生pimaradiene/abietadiene型产物
- EpTPS3产生casbene
- EpTPS7与EpTPS1或CfTPS14共表达产生ent-kaurene。
研究结论
本研究建立的结合代谢物靶向转录组、定制参考数据库、系统发育分析和体内外功能验证的策略，能够高效地从非模式植物中鉴定和注释二萜代谢相关基因，并可为合成生物学提供酶模块和平台。