Dissection of Tomato Lycopene Biosynthesis through Virus-Induced Gene Silencing
- 作者
- Elio Fantini, Giulia Falcone, Sarah Frusciante, Leonardo Giliberto, Giovanni Giuliano
- 单位
- Italian National Agency for New Technologies, Energy, and Sustainable Development, Casaccia Research Center, Roma, Italy; Genelab, Palazzolo Acreide (SR), Italy; University of Rome "La Sapienza", Roma, Italy
- 杂志
- Plant Physiology（2013）
- DOI
- 10.1104/pp.113.224733
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
番茄果实中番茄红素生物合成途径的九个候选基因（PSY1/2/3、PDS、ZDS、ZISO、CrtISO、CrtISO-L1、CrtISO-L2）缺乏系统的体内功能研究，需要在同一遗传背景下进行反向遗传学解析。
研究策略
利用果实特异性病毒诱导基因沉默（VIGS）结合花色苷视觉报告系统，在番茄F6DR果实中分别沉默九个基因，并通过高分辨率LC-PDA-MS对45种类胡萝卜素异构体进行定性和定量分析，结合已知突变体表型比较，解析各基因的体内功能。
核心内容
本研究利用果实特异性病毒诱导基因沉默（VIGS）结合花色苷视觉报告系统，在番茄F6DR果实中系统敲低番茄红素生物合成途径的九个候选基因（PSY1/2/3、PDS、ZDS、ZISO、CrtISO、CrtISO-L1/L2），首次在同一遗传背景下对高等植物类胡萝卜素合成途径进行反向遗传学解析。通过高分辨率LC-PDA-MS鉴定并定量了45种类胡萝卜素异构体。结果显示，VIGS沉默效率达85%–100%；PDS沉默使总类胡萝卜素降低55%，ZDS沉默导致ζ-胡萝卜素大量积累，CrtISO沉默使番茄红素近乎消失且ζ-胡萝卜素、神经孢烯和原番茄红素以4:2:1比例累积；ZISO沉默果实中光照可部分恢复番茄红素合成；CrtISO-L2沉默则使番茄红素显著增加。据此提出番茄红素生物合成由三个功能单元组成——PSY1催化生成15-顺式八氢番茄红素，PDS/ZISO催化生成9,9'-双顺式ζ-胡萝卜素，ZDS/CrtISO催化生成全反式番茄红素，CrtISO-L1/L2启动以all-trans-ζ-胡萝卜素为中间物的代谢侧支，并存在至少三个转录调控回路。该模型系统揭示了番茄红素合成的体内功能分工与调控机制。
创新点
首次对高等植物类胡萝卜素生物合成途径进行系统性反向遗传学研究；利用VIGS与花色苷报告系统在同一遗传背景下实现多基因功能解析；高分辨率质谱与C30反相色谱联用鉴定包括线性叶黄素在内的45种类胡萝卜素异构体；提出番茄果实中番茄红素生物合成由三个功能代谢单元及一个代谢侧支组成的模型。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 番茄（Solanum lycopersicum）F6DR果实 | 番茄红素生物合成 | PSY1 | Phytoene synthase 1 | 催化 | 催化两分子GGPP缩合生成15-顺式八氢番茄红素，沉默表型与yellow flesh突变体相似 |
| 番茄（Solanum lycopersicum）F6DR果实 | 番茄红素生物合成 | PSY2 | Phytoene synthase 2 | 催化 | 果实中表达较低，沉默仅导致γ-胡萝卜素轻微降低，非主要功能 |
| 番茄（Solanum lycopersicum）F6DR果实 | 番茄红素生物合成 | PSY3 | Phytoene synthase 3 | 催化 | 果实中表达极低，沉默导致八氢番茄红素、八氢番茄红素和δ-胡萝卜素等降低，可能存在交叉沉默 |
| 番茄（Solanum lycopersicum）F6DR果实 | 番茄红素生物合成 | PDS | Phytoene desaturase | 催化 | 催化15-顺式八氢番茄红素脱氢，沉默使总类胡萝卜素降低55%，积累八氢番茄红素和八氢番茄红素 |
| 番茄（Solanum lycopersicum）F6DR果实 | 番茄红素生物合成 | ZDS | ζ-Carotene desaturase | 催化 | 催化9,9'-双顺式ζ-胡萝卜素脱氢，沉默导致ζ-胡萝卜素大量积累和神经孢烯微量积累 |
| 番茄（Solanum lycopersicum）F6DR果实 | 番茄红素生物合成 | ZISO | ζ-Carotene isomerase | 催化 | 催化15-顺式双键异构化，沉默导致番茄红素减少，光照可部分恢复其功能 |
| 番茄（Solanum lycopersicum）F6DR果实 | 番茄红素生物合成 | CrtISO | Prolycopene isomerase | 催化 | 催化顺式双键异构化为反式，沉默导致番茄红素消失，积累原番茄红素等4:2:1混合物，与tangerine突变体相似 |
| 番茄（Solanum lycopersicum）F6DR果实 | 番茄红素生物合成 | CrtISO-L1 | CrtISO-like 1 | 催化 | 沉默导致all-trans-ζ-胡萝卜素消失，推测参与代谢侧支 |
| 番茄（Solanum lycopersicum）F6DR果实 | 番茄红素生物合成 | CrtISO-L2 | CrtISO-like 2 | 催化 | 沉默导致all-trans-ζ-胡萝卜素消失，番茄红素显著增加，参与竞争性代谢侧支 |
关键发现
- VIGS沉默效率为85%-100%（PSY2和PSY3略高于70%）
- PDS沉默使总类胡萝卜素降低55%，ZDS沉默导致ζ-胡萝卜素大量积累
- CrtISO沉默导致番茄红素近乎消失，ζ-胡萝卜素、神经孢烯和原番茄红素以4:2:1比例累积，而tangerine突变体为4:1:2
- ZISO沉默果实中光照可部分恢复番茄红素合成，暗处理使类胡萝卜素总量降低约40%
- CrtISO-L2沉默使番茄红素显著增加
- all-trans-ζ-胡萝卜素在ZDS沉默时大量增加，在CrtISO-L1/L2沉默时消失
- 鉴定了45种类胡萝卜素异构体，包括羟基化衍生物。
研究结论
番茄果实中番茄红素生物合成由三个功能单元组成：PSY1催化合成15-顺式八氢番茄红素，PDS/ZISO共同催化合成9,9'-双顺式ζ-胡萝卜素，ZDS/CrtISO共同催化合成全反式番茄红素；CrtISO-L1和CrtISO-L2启动以all-trans-ζ-胡萝卜素为中间物的代谢侧支；并存在至少三个转录调控回路，其中沉默脱氢酶可诱导同一单元内下游异构酶的表达。