The PYL4 A194T Mutant Uncovers a Key Role of PYR1-LIKE4/PROTEIN PHOSPHATASE 2CA Interaction for Abscisic Acid Signaling and Plant Drought Resistance
- 作者
- Gaston A. Pizzio, Lesia Rodriguez, Regina Antoni, Miguel Gonzalez-Guzman, Cristina Yunta, Ebe Merilo, Hannes Kollist, Armando Albert, Pedro L. Rodriguez
- 单位
- Instituto de Biologia Molecular y Celular de Plantas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Politecnica de Valencia; Departamento de Cristalografía y Biología Estructural, Instituto de Química Física Rocasolano, Consejo Superior de Investigaciones Científicas; Institute of Technology, University of Tartu
- 杂志
- Plant Physiology（2013）
- DOI
- 10.1104/pp.113.224162
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过工程化ABA受体增强植物抗旱性，同时避免组成型活性受体带来的生长抑制副作用
研究策略
构建PYL4随机突变体库（约10000个克隆），通过酵母双杂交筛选与PP2CA发生ABA非依赖性互作的突变，获得A194T突变，并综合运用体外酶活、蛋白互作、转基因植物表型及气孔/水分利用效率分析验证其功能
核心内容
该研究通过构建约一万个克隆的PYL4随机突变体库，利用酵母双杂交筛选与PP2CA发生ABA非依赖性互作的突变，获得A194T突变体。体外酶活实验显示，PYL4A194T在无ABA时对PP2CA活性有20%的微弱抑制，在1μM ABA下抑制增强；在0.5-1μM ABA下，该突变体对PP2CA介导的ABF2、ABI5、SLAC1去磷酸化的保护能力比野生型PYL4高2-3倍。在拟南芥中过表达PYL4A194T，无外源ABA时RAB18和RD29B表达分别上调6倍和23倍，气孔导度显著降低，蒸腾减少，水分利用效率提高。干旱处理后，野生型存活率为0%，PYL4过表达约30%，而PYL4A194T过表达达60-70%，脱水12小时后复水存活率约40%。PYL4A194T通过增强受体与PP2CA的互作，在基础ABA水平下部分缓解ABA反应基因的抑制，避免了组成型活性受体带来的生长抑制副作用，为作物抗旱性改良提供了新策略。
创新点
首次通过等位基因库筛选获得PYL4 A194T突变，该突变增强受体与PP2CA的互作（即使在无ABA条件下也能形成复合物），但并未产生强的组成型磷酸酶抑制，而是改善了ABA依赖的PP2CA抑制；该突变在植物中表达稳定，可增强ABA敏感性、降低气孔导度、提高水分利用效率和抗旱性
研究对象（15）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | ABA信号通路 | PYL4 | PYL4 | 调控 | ABA受体，酵母双杂交筛选的诱饵蛋白，A194T突变增强与PP2CA的互作 |
| Saccharomyces cerevisiae | ABA信号通路 | PP2CA | PP2CA | 催化 | A组蛋白磷酸酶2C，催化底物去磷酸化，PYL4A194T增强对其抑制 |
| Escherichia coli | ABA信号通路 | PYL4 | PYL4A194T | 调控 | 重组蛋白用于体外互作和磷酸酶活性实验 |
| Escherichia coli | ABA信号通路 | PP2CA | PP2CA（ΔN） | 催化 | 用于亲和纯化和pull-down实验 |
| Nicotiana benthamiana | ABA信号通路 | PYL4 | PYL4A194T | 调控 | BiFC实验证实与PP2CA在细胞质中内源ABA水平下互作增强 |
| Nicotiana benthamiana | ABA信号通路 | PP2CA | PP2CA | 催化 | BiFC实验验证与PYL4A194T的互作 |
| Arabidopsis thaliana | ABA信号通路 | PYL4 | PYL4A194T | 调控 | 35S过表达，增强ABA敏感性、降低气孔导度、提高抗旱性 |
| Arabidopsis thaliana | ABA信号通路 | PP2CA | PP2CA | 催化 | 负调控ABA信号，PYL4A194T改善对其的ABA依赖抑制 |
| Arabidopsis thaliana | ABA信号通路 | HAB1 | HAB1 | 催化 | 另一A组PP2C，PYL4A194T对其作用与PYL4无显著差异 |
| Arabidopsis thaliana | ABA信号通路 | OST1 | OST1（SnRK2.6） | 催化 | 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，PP2CA的底物之一 |
| Arabidopsis thaliana | ABA信号通路 | ABF2 | ABF2 | 调控 | ABRE结合转录因子，去磷酸化保护实验中的底物 |
| Arabidopsis thaliana | ABA信号通路 | ABI5 | ABI5 | 调控 | ABA-insensitive5转录因子，去磷酸化保护实验中的底物 |
| Arabidopsis thaliana | ABA信号通路 | SLAC1 | SLAC1 | 转运 | S型阴离子通道，调节气孔关闭，PP2CA的底物 |
| Arabidopsis thaliana | ABA响应 | RAB18 | RAB18 | 调控 | ABA响应基因，在PYL4A194T过表达株中基础表达上调6倍 |
| Arabidopsis thaliana | ABA响应 | RD29B | RD29B | 调控 | 脱水响应基因，在PYL4A194T过表达株中基础表达上调23倍 |
关键发现
- 构建了约10,000个克隆的PYL4等位基因库，筛选出多个ABA非依赖互作突变（H82R、A194T、F130Y C176R等）
- 体外pNPP实验显示PYL4A194T在无ABA时对PP2CA活性有20%的微弱抑制，在1μM ABA下抑制增强
- 在0.5-1μM ABA下，PYL4A194T对PP2CA介导的ABF2、ABI5、SLAC1去磷酸化的保护能力比PYL4高2-3倍
- 无外源ABA时，35S:PYL4A194T转基因植物中RAB18和RD29B表达分别上调6倍和23倍
- 气孔导度显著低于非转基因和35S:PYL4植物，蒸腾降低，水分利用效率提高
- 干旱处理后存活率：野生型0%，PYL4过表达约30%，PYL4A194T过表达约60-70%
- 脱水12小时后复水存活率约40%
- 气孔密度比野生型低约10%
研究结论
通过等位基因库筛选和工程化PYL4 A194T突变增强与PP2CA的互作，可在基础ABA水平下部分缓解ABA反应基因的抑制、减小气孔开度、降低蒸腾、提高水分利用效率和抗旱性，且避免了组成型活性受体在营养组织中表达被抑制的缺陷，为改良作物抗旱性提供了新策略